Introducción
Actualmente se utilizan en el mundo más de 800 diferentes plaguicidas. Para la mayoría de ellos existe una regulación que establece los niveles permitidos en alimentos y agua. Estos niveles requieren un control. Para este tipo de análisis, se suelen aplicar métodos analíticos para multi-residuos de forma de reducir la carga de trabajo. Muchos plaguicidas son difíciles o imposibles de analizar por GC-MS, pero pueden identificarse y cuantificarse por métodos para multi-residuos utilizando LC-MS-MS. En este tipo de aplicación, normalmente se utiliza el monitoreo de reacciones múltiples (MRM) como tipo de barrido, es decir, el monitoreo de la cantidad de iones producida luego de la selección de un ion padre y un ion hijo de ese padre para cada analito. Sin embargo y sin lugar a dudas, una sola transición MRM por plaguicida no es suficiente para validar su presencia. Habitualmente se usa una segunda transición para confirmar los resultados. La mayoría de las muestras (frutas, verduras, etc.) contienen menos del 10% de los plaguicidas monitoreados. En consecuencia, en más del 90% de los casos, la transición confirmatoria no es realmente necesaria, dado que el plaguicida no está presente y sólo se desperdicia tiempo valioso. Por esta razón se desarrolló un método para identificar y cuantificar plaguicidas con una sola transición. Junto con esto, usando el instrumento híbrido 3200 Q TRAP® (triple cuadrupolo con una trampa de iones lineal), la confirmación del compuesto detectado se realiza mediante el algoritmo de Adquisición Dependiente (IDA) del escaneo intensificado del ion producto (EPI) disparado por la MRM. Como resultado, el sistema MS-MS aprovecha el tiempo principalmente para lograr un monitoreo rápido del mayor número de compuestos posible. Sólo cuando se detecta un plaguicida en el primer análisis, se realiza una medición confirmatoria automática. Esta segunda medición produce espectros de masa completos gracias a la disociación inducida mediante colisión, que pueden cotejarse con una biblioteca de espectros de plaguicidas.
Preparación de la muestra
Consultar con nuestra Gerencia de Capacitación y Aplicaciones detalles de la preparación de muestra. La misma se basa en una rápida extracción en fase y posterior corrida cromatográfica utilizando una columna C18. El análisis mediante LC-MS-MS se realiza en modo ESI positivo; utilizando el algoritmo IDA para 297 MRMs produciendo, de ser necesario, 3 espectros EPI.
Cromatografía líquida
Se utilizó un sistema HPLC Shimadzu Prominence. La separación HPLC se llevó a cabo a través de una columna C18 (50 mm, 5 µm, 2 mm i.d., 12.5 nm), usando un gradiente de H2O/CH3OH + 5 mM de formiato de amonio (A:B = 80:20 a 10:90 en 11 min; 10:90 en 12 min, y equilibrio hasta 15 min), con un caudal de 200 µL/min y una temperatura de 20°C. El volumen inyectado fue de 20 µL.
Detección mediante espectrometría de masa
Todos los experimentos se realizaron en un sistema LC-MS-MS Q TRAP® 3200, equipado con una fuente Turbo V™ y una sonda TurboIonSpray® (450°C) en polaridad positiva. Se desarrolló un experimento IDA conteniendo 297 transiciones MRM (tiempo de lectura individual: 5 ms; tiempo de transición: 1 ms) fijando una energía de colisión (CE) = +20; 35 o 50V para escaneos de reconocimiento y para la adquisición dependiente de la información se fijó 3 escaneos EPI a CE = +20; 35 y 50V con una velocidad de barrido de 4000 amu/s y tiempo de llenado de la trampa 100 ms. Para la identificación del los picos durante los escaneos de reconocimiento se utilizó el método de substracción dinámica del fondo (DBS). La identificación de las sustancias se basó en la búsqueda contra biblioteca de espectros de obtenidos a CE = +20; 35 y 50V.
Resultados
Normalmente, para un análisis cuantitativo, se utiliza el monitoreo de reacciones multiples (MRM) de los espectrómetros de masas de triple cuadrupolo, debido a su elevada selectividad y sensibilidad. Para detectar muchos plaguicidas en un método de analitos múltiples, se necesita una celda de colisión rápida. La celda LINAC® (Linear Accelerator), utilizada en los sistemas de triple cuadrupolo y en los híbridos de trampa de iones lineal de ABSCIEX, usa un campo eléctrico axial para acelerar los iones producto luego de su fragmentación. Esto permite reducir el tiempo de lectura individual con una mínima reducción en la intensidad de la señal. En estudios anteriores se ha encontrado que 25 ms son suficientes para detectar 100 plaguicidas usando un sistema LC-MS-MS API 2000™.2 La sensibilidad intensificada del sistema Q TRAP® 3200 puede utilizarse para reducir el tiempo de lectura por cada MRM, aumentando así el número de compuestos detectados. En la Figura 1 se muestra un estándar de 300 plaguicidas (100 ng/mL) detectados en MRM con un tiempo de lectura de 5 ms. La Figura 2 ejemplifica la sensibilidad con 12 plaguicidas seleccionados en una concentración de 1 ng/mL. Los datos MRM pueden utilizarse para cuantificar plaguicidas en extractos de frutas y verduras. En la Figura 3 se da un ejemplo de varios extractos, donde se encontró y cuantificó tebufenocida (11 µg/kg) en una muestra de zanahoria. Para confirmar los datos de la cuantificación, se utilizaron los espectros del escaneo EPI obtenidos en forma automática para cotejar contra una biblioteca de espectros. El valor índice de pureza calcula el grado de ajuste entre los espectros desconocidos y los de la biblioteca y (Figura 4). Se utilizó la información obtenida luego del DBS para disparar los escaneos EPI tras detectar la transición MRM. Esto permite obtener espectros MS-MS de alta calidad, con una confirmación incluso para los compuestos que co-eluyen.
Fig. 1 Estándar de 300 plaguicidas (100 ng/mL) detectados en MRM.
Conclusiones
El método LC-MS-MS desarrollado se puede utilizar para cuantificar 300 plaguicidas preseleccionados presentes en extractos de fruta y vegetales. Los niveles de sensibilidad del sistema Q TRAP® 3200 son lo suficientemente elevados como para detectar plaguicidas en una concentración de 10 µg/kg (nivel máximo de residuo en alimentos para bebés). Una biblioteca espectral conteniendo el espectro intensificado del ion producto obtenido a tres energías de colisión diferentes confirma los compuestos detectados en los niveles requeridos para múltiples matrices de alimentos.
Referencias
(1) J. Klein, L. Alder: Journal of AOAC Vol.86 No.5 (2003) 1015-1037
(2) J. Klein, L. Alder, A. Schreiber: Biosystems Solutions 8 (2003) 12-13
