Como técnicos en cromatografía, muchos de nosotros no somos conscientes de cuán crítico es el pH en el desarrollo del método, incluso, a veces, es considerado un factor intrascendente, que podría tener un efecto insignificante en nuestros análisis.

Sin embargo, la verdad es que el pH puede hacer que su análisis sea un éxito o un fracaso; la elección del pH correcto o, más importante aún, de un pH optimizado en un método puede ser el único paso más significativo al desarrollar un método.

No importa si usted está llevando a cabo un análisis en fase reversa, un HILIC o en intercambio iónico, el pH de su muestra y de la fase móvil siempre serán fundamentales para lograr los mejores resultados posibles en su análisis.

Ahora debemos revisar nuestra memoria y recordar la definición más simple de pH que hayamos estudiado en la escuela, que, para nuestro malestar puede tener varias. Sin embargo, como aquí estamos dilucidando la importancia del pH, utilizaremos la más simple. S.P.L. Sorenson, un químico danés, fue quien presentó en 1909 el concepto de pH.

pH

• La definición más básica puede ser que el pH es una medida de la acidez o alcalinidad de sustancias solubles en agua.

Algunas más complejas son:

• La medida de concentración de iones de hidrógeno (H+) de un líquido, en relación con la de una solución estándar determinada.

• Matemáticamente, el pH es el logaritmo negativo de la concentración de iones de hidrógeno [H+], que se expresa en molaridad.

pH = – Log[H+]

Ahora, surge la pregunta, ¿qué es “p” en pH?

Siempre que vea una “p” delante de un valor como pH, pKa, pKb significa que está tratando con el logaritmo negativo del valor que le sigue a la “p”.

El significado exacto de la “p” es cuestionado, pero de acuerdo con la Fundación Carlsberg, donde Sorensen trabajó en 1909, pH significa “potencial de hidrógeno”. Por lo tanto, la “p” también puede hacer referencia a la potencia del valor que le sigue a “p”.

De este modo, el pH se define mediante el logaritmo negativo de la actividad de ion hidrógeno en una solución.

El agua pura tiene una baja conductividad y está solo levemente ionizada, sin embargo, cuando el agua se disocia forma:

H2O = H+ y OH–

Donde, H+ es la actividad de los iones hidrógeno y OH– es la actividad de los iones hidroxilo.

Las concentraciones de iones de H+ y OH– son iguales a 25 grados Celsius, 1 x 10-7 iones/litro.

La escala de pH se obtiene de la propiedad de autoionización del agua.

La ecuación anterior establece una escala de pH de 0 a 14, lo que da una manera conveniente de expresar las 14 órdenes de magnitud de los iones [H+].

Grado de ionización o grado de disociación

Para comprender el verdadero significado del pH en la fase móvil, primero necesitamos comprender el grado de ionización o grado de disociación de los compuestos básicos o ácidos. El pH de un compuesto puede indicar si usted está tratando con un ácido o una base, pero ofrece información limitada indicando la verdadera concentración de ácido o base, y allí es donde surge el concepto de grado de ionización o disociación.

pKa = [- Log Ka]

pKb = [- Log Kb]

Ka = constante de disociación ácida o concentración de iones [H+].

Kb = constante de disociación básica o concentración de iones [OH–]. Ka para la mayoría de los ácidos débiles = 10-2 a 10-14 y, por lo tanto, pKa para la mayoría de los ácidos débiles está entre 2 y 14.

Cuanto más fuerte sea el ácido, más pequeño será su valor pKa y cuanto más fuerte sea la base, mayor será su valor pKb. En adelante, usaremos mayormente el término “pKa” para explicar el concepto.

Todos los analitos que pueden ser analizados mediante cromatografía en fase reversa pueden ser, al menos, ligeramente ionizados y por lo tanto, pueden ser “ácidos débiles” o “bases débiles”. Por lo tanto, cuando trabaje con estos compuestos polares (ácidos o bases débiles), siempre debe conocer los valores de pKa o pKb de los compuestos, debido a que eso le ayudará a decidir el pH correcto para la fase móvil.

Para alcanzar el objetivo de resolución de los analitos y una buena forma de pico en la cromatografía por fase reversa, la interacción hidrofóbica y alguna interacción iónica desempeñan un papel importante en la selectividad entre la fase estacionaria y los analitos.

Para lograr esto, el objetivo principal de un químico debe ser la obtención del analito deseado en un estado simple, estado desprotonado o no ionizado.

El estado de ionización del analito afecta directamente al grado de interacción del analito con la fase estacionaria.

• Cuando una molécula es ionizada, es más polar y, por lo tanto, es más probable que participe por enlaces de hidrógeno. En fase reversa con fase móvil acuosa, el analito pasará menos tiempo en interacciones hidrofóbicas con fase estacionaria y más tiempo formando enlaces de hidrógeno con la parte acuosa de la fase móvil en comparación con la molécula neutra, lo que resultará en una menor retención de las moléculas polares.

• Cuando haya concentraciones significativas tanto de formas ionizadas como neutras de un analito, la forma ionizada tendrá menos interacción hidrofóbica mientras que la neutra tendrá más interacción hidrofóbica, lo que dará como resultado picos anchos y asimétricos.

• Los pocos grupos libres silanoles o los contaminantes presentes en el sílice pueden participar en interacciones iónicas con el estado ionizado de los analitos, lo que puede llevar a una mala forma de pico o a su irreproducibilidad.

Ahora, es posible predecir el estado de ionización del analito en relación con el valor pH de la fase móvil conociendo el valor pKa del analito, en otros términos podemos controlar el estado de ionización del analito ajustando simplemente el pH de la fase móvil.

Por lo tanto, para los ácidos:

Para las bases:

Los valores en las tablas anteriores pueden proporcionar una guía para determinar el pH de la fase móvil en función del valor pKa del analito. Para una neutralización máxima del analito, el pH de la fase móvil debe estar al menos 2 unidades por encima o por debajo del valor pKa.

Como la cromatografía de LC trata con compuestos polares parciales o totales, los dos principales desafíos que se presentan en la cromatografía de LC es la retención de los compuestos ácidos y la forma de pico de los compuestos básicos; afortunadamente, ambos se pueden solucionar eligiendo y controlando el pH optimizado correcto para su muestra y la fase móvil. La siguiente imagen representa acertadamente los beneficios de elegir el pH de fase móvil correcto en relación con la retención y la forma de pico de los compuestos ácidos y básicos.

Por lo tanto, la próxima vez que se encuentre desarrollando u optimizando un método, considere al pH como uno de los factores más importantes y tendrá condiciones favorables para lograr la retención, la resolución y la forma de pico deseada, incluso para los analitos más desafiantes.

Fuente: Blog Phenomenex.