El LC-MS de alta sensibilidad y alta selectividad es una poderosa herramienta para los estudios farmacocinéticos, clínicos y metabólicos. El análisis de muestras biológicas como plasma, suero y orina requiere un proceso de tratamiento previo que minimiza la influencia de proteínas y otras sustancias presentes en la matriz de la muestra, antes de que ésta sea introducida dentro del LC-MS. Recientemente se han desarrollado múltiples columnas RAM (“restricted access media”) que permiten realizar un tratamiento previo en línea de muestras biológicas. Columnas de fase reversa1-4, de sílica con grupos funcionales mixtos, de sílica semipermeable6, y de sílica con dioles7-8 son los más recientes aportes destinados a lograr un tratamiento previo automatizado.

Por una modificación de la sílica porosa con metil-celulosa, seguida de una modificación de la superficie interna con ODS9, recientemente se preparó una columna MC-ODS para fase reversa inmovilizada con metil-celulosa (Shim-pack MAYI-ODS). La superficie externa cubierta con metil-celulosa previene la adsorción con proteínas, mientras que las moléculas pequeñas pueden retenerse en la superficie interna por medio de la interacción hidrofóbica con los grupos ODS. Las columnas Shim-pack MAYI-ODS permiten una introducción directa de muestras biológicas tales como plasma, utilizando una técnica de intercambio de columnas9-10. En la columna de fase reversa RAM, los compuestos polares apenas tienen afinidad de retención, ya que dicha afinidad se debe a las interacciones hidrofóbicas. Por esta razón, la recuperación de estos compuestos no es muy elevada. El MC-SCX ( Shim-pack MAYI-SCX )11-12 y el Shim-pack MAYI-SAX poseen grupos de intercambio de iones dentro de los poros y pueden aplicarse con éxito al análisis de los compuestos hidrofílicos presentes en el plasma.

Serie Shim-pack MAYI

Las columnas Shim-pack MAYI son columnas de pretratamiento en línea para HPLC, y están diseñadas para extraer y concentrar analitos en muestras biológicas. El material de empaque está compuesto por partículas esféricas de sílica, de alta pureza y totalmente porosas. La superficie exterior de estas partículas está revestida con un polímero de metil-celulosa, y la superficie interior de los poros está químicamente unida a una fase estacionaria, como el C18. Los modelos de MAYI Series cuentan con una amplia variedad de fases estacionarias, y las cuales se enumeran en la Tabla 1.

Columna	Modificación de la superficie interna
Shim-pack MAYI-ODS (G)	C18
Shim-pack MAYI-C1 (G)	C1
Shim-pack MAYI-C4 (G)	C4
Shim-pack MAYI-C8 (G)	C8
Shim-pack MAYI-C14 (G)	C14
Shim-pack MAYI-SCX (G)	Grupo sulfonato
Shim-pack MAYI-SAX (G)	Grupo trimetilamonio

Tabla 1: Lista de columnas Shim-pack MAYI Series.

Las proteínas presentes en las muestras biológicas se eluyen desde la columna MAYI por exclusión de tamaño, mientras que las pequeñas moléculas-objetivo pueden penetrar en los poros, donde son atrapadas en la fase estacionaria ( Figura 1 ).

Figura 1: Imagen de la superficie de una partícula en una columna MAYI.

Al incorporar una columna MAYI como columna para tratamiento previo en un sistema de intercambio de columnas, las proteínas en las muestras se remueven automáticamente, lo que permite analizar los pequeños compuestos de interés.

La desproteinización de las muestras y el análisis de los compuestos de interés pueden llevarse a cabo en forma automática y sin interrupciones ( Figura 2 ).

Figura 2: Desproteinización de una muestra de plasma utilizando el Shim-pack MAYI-ODS (G).

Configuración del sistema

La configuración típica del sistema Co-Sense for BA se muestra en la Figura 3. La muestra inyectada es transportada desde el muestreador automático hasta la columna MAYI a través de la Bomba C. Los compuestos de interés pueden atraparse y concentrarse en la columna MAYI, mientras que las proteínas son eluidas. Una vez finalizado el proceso de desproteinización, los compuestos de interés retenidos en la columna MAYI se transportan a la columna de análisis (girando la posición de la válvula), donde se separan y se detectan con el detector que corresponda (UV, MS, MS-MS, etc.).

Figura 3: Configuración básica del sistema Co-Sense for BA.

Generalmente un sistema de intercambio de columnas cuenta con dos bombas para la formación del gradiente binario, otra bomba para cargar la muestra, una válvula de 6 vías y 2 posiciones, un muestreador automático, un horno de columna, y un detector como módulos principales. En el caso del Co-Sense for BA, a menudo se utilizan para un análisis más efectivo la válvula de intercambio de solvente en la Bomba C, y una bomba adicional (Bomba D) para la dilución de la muestra (Figura 3). La válvula de intercambio de solvente permite lavar el canal de tratamiento previo con solvente C2 (ó C3, ó C4) para reducir la contaminación mientras se analizan los compuestos de interés. La bomba de dilución es útil para acelerar la débil interacción entre proteínas y analitos, y da como resultado una mejora en la recuperación.

Figura 4: Configuración de válvula doble del sistema Co-Sense for BA.

Como se muestra en la Figura 4, la configuración doble de válvulas permite al sistema operar como sistema de gradiente binario o como sistema Co-Sense for BA con un solo giro de la válvula izquierda. Esta válvula se utiliza para conectar el muestreador automático en la línea de flujo, tanto para el sistema Co-Sense for BA como para el sistema binario, siendo así simplemente una válvula de selección para el direccionamiento del muestreador automático.

Desarrollo de métodos para MAYI-ODS

Desproteinización

El tiempo necesario para eluir las proteínas de la columna MAYI depende del tamaño de la columna, del caudal, del factor de dilución y del solvente de carga. Para evitar la oclusión de la columna analítica y de la tubería, la válvula de 6 vías conectada a la columna MAYI y a la columna analítica debe estar en la posición hacia la columna MAYI, hasta que el proceso de elución de las proteínas haya finalizado. La curva de elución de proteínas de la columna MAYI se monitorea en el UV (µ=260 nm). En la Tabla 2 se muestra el tiempo necesario para que la absorción de proteínas descienda a A=0,001 después de la inyección del plasma. Cuando se trabaja con un factor de dilución de 8, un caudal de 3 mL/min, y un volumen de inyección menor a 50µL, se requieren aproximadamente 2 minutos para eluir las proteínas del MAYI-ODS (G).

Volumen de inyección	1 mL/min	2 mL/min	3 mL/min	4 mL/min
5µL	2,8 min	1,2 min	0,8 min	0,7 min
10µL	2,9 min	1,5 min	1,0 min	0,8 min
20µL	-	1,8 min	1,2 min	1,0 min
50µL	-	2,5 min	1,7 min	1,3 min
100µL	-	3,4 min	2,2 min	1,8 min

Tabla 2: Tiempo de elución de proteínas plasmáticas del Shim-pack MAYI-ODS (G) medido como el tiempo requerido para que la absorbancia a 260nm decrezca a menos de 0,001 luego de la inyección. Factor de dilución: 8 (flujo-C/flujo-D=1/7). Solvente de carga: acetato de amonio 10 mM; acetonitrilo 95:5, MAYI-ODS (4,6 mm i.d. x 10 mmL).

Solvente de carga (fase móvil del tratamiento previo)

El solvente de carga (fase móvil C1 en las Figuras 3 y 4) cumple la función de transportar las muestras inyectadas al guardacolumna. Sustancias de bajo peso molecular, como las drogas, coexisten con las proteínas en las muestras biológicas. Algunas veces estas drogas son removidas junto con las proteínas durante el proceso de desproteinización en el MAYI-ODS, lo que da como resultado una pobre recuperación de las drogas.

Es importante debilitar la ligazón entre proteínas y drogas para alcanzar altas tasas de recuperación, optimizando el solvente de carga. El incremento de la fuerza iónica y del contenido orgánico en el solvente de carga es un factor efectivo para la mejora de la recuperación ( Figura 5 ).

Figura 5: Tasa de recuperación de drogas presentes en plasma, con diferentes solventes de carga ( 0,5 µg/mL fortificado; volumen de inyección: 50 µL ).

Habitualmente, para lograr un elevado factor de recuperación, puede añadirse al solvente de carga una concentración de 10% (o menor) de acetonitrilo. Puesto que el pI de albúmina en muestras de plasma es aproximadamente 4-5, es preferible que el pH del solvente de carga se ajuste a 2-3 ó 6-7, para prevenir una oclusión por precipitación de albúmina. Además, una forma conveniente de ahorrar trabajo consiste en utilizar la misma solución de carga como fase móvil A para el análisis cromatográfico.

Por otra parte, el sistema Co-Sense for BA cuenta con una bomba extra ( Bomba D ) para diluir la muestra inyectada con solvente de carga por medio de una función en línea. Las muestras inyectadas pueden diluirse automáticamente con un solvente de carga óptimo para separar las drogas de las proteínas. Cuando el solvente de carga no provee una recuperación suficiente, la dilución en línea es un auxilio efectivo para mejorarla. Generalmente se utiliza el mismo solvente de carga como solvente C1 para realizar la dilución.

Aplicación

MAYI-ODS

La columna MAYI es una columna de tratamiento previo en línea que permite lograr una muy eficiente desproteinización y una estabilidad a largo plazo por medio de una optimización de las partículas y de la tecnología de revestimiento. También permite múltiples aplicaciones sobre muestras biológicas. A continuación, a modo de ejemplo, se muestra el análisis de cinco drogas básicas mezcladas con plasma en un ciclo de 6 minutos por medio del sistema Co-Sense for BA con LC-MS ( Figura 6 ).

Figura 6 (A) y (B): Cromatogramas SIM de 5 drogas: (a) estándar, (b) fortificadas con plasma. 1: metoprolol; 2: propranolol; 3: lidocaína; 4: dibucaína; 5: bupivacaína. Concentración de cada compuesto: 1 µg/mL; volumen de inyección: 5 µL.

Se monitorearon estas drogas con un detector MS configurado para la ionización en modo ESI positivo, utilizando el monitoreo selectivo de iones (SIM) en los iones [M+H]+ de cada componente. Las condiciones analíticas se muestran en la Tabla 3.

Columna para tratamiento previo	Shim-pack MAYI-ODS (G) (4,6 mmi.d. x 10 mm)
Fase móvil de extracción	Acetato de amonio 10 mM; acetonitrilo 95:5
Caudal	3 mL/min
Temperatura de la columna	45ºC
Volumen de inyección	5 µL ó 10 µL
Tiempo de extracción	1 min
Factor de dilución	8
Columna de análisis	Phenomenex Mercury MS (4,0 mm i.d. x 10 mm, 5 µm)
Fase móvil	A: acetato de amonio 10 mM B: acetonitrilo
Programa de gradiente	B 5% (0-0,5 min) ® B 90% (3-4 min) ® B 5% (4,01 min) ® STOP (5 min)
Caudal	0,8 mL/min
Factor de separación	1 : 3 (espectrómetro de masas : desperdicio)
Temperatura de la columna	45ºC
Ionización	Electrospray
Voltaje de ionización	+ 4,5 kV
Gas nebulizante	4,5 L/min

Tabla 3: Condiciones analíticas.

La muestra de plasma dio un perfil de elución similar al de la muestra estándar. El método analítico mostró un excelente desempeño en cuanto a repetibilidad, recuperación y linealidad ( Tabla 4 y Figura 7 ).

Compuesto	RSD (%), n=5 (Estándar)	RSD (%), n=5 Fortificad con plasma)	Recuperación (%)
metoprolol	1,2	1,0	95,0
Propranolol	1,0	1,4	97,4
Lidocaína	0,9	2,6	94,0
Dibucaína	1,6	2,5	107,7
Bupivacaína	0,7	1,5	97,1

Tabla 4: Repetibilidad y recuperación de cada compuesto (1 µg/mL, 5 µL).

**

Figura 7:** Curvas de calibración de 5 drogas. Inyectados 10 mL de plasma de rata fortificados con drogas. 1: Metoprolol - r=0,99954; 2: Propranolol - r=0,99958; 3: Lidocaína - r=0,99981; 4: Dibucaína - r=0,99978; 5: Bupivacaína - r=0,99986. 10 – 1000 ng/mL, 10 mL, n=5.

La Figura 8 muestra un cromatograma SIM de warfarina y cetoprofeno en plasma humano. Las drogas presentes en muestras biológicas pueden analizarse en forma sencilla con un método optimizado ( Tabla 5 ) de tratamiento previo automático.

Columna para tratamiento previo	Shim-pack MAYI-ODS (G) (4,6 mm i.d. x 10 mm)
Fase móvil de extracción	Buffer formiato de amonio 10 mM, pH=3.7; acetonitrilo 90:10
Caudal	3 mL/min
Temperatura de la columna	40ºC
Volumen de inyección	10 µL
Tiempo de extracción	2 min
Factor de dilución	8
Columna de análisis	Shim-pack FC-ODS (4,6 mm i.d. x 75 mmL)
Fase móvil	A: buffer formiato de amonio 10 mM, pH=3.7 B: acetonitrilo
Programa de gradiente	B 50% (0 min) ® B 50% (2 min) ® B 90% (5 min) ® B 90% (8 min) ® B 50% (8 min) ® STOP (10 min)
Caudal	0,8 mL/min
Split	No
Temperatura de la columna	40ºC
Ionización	Electrospray
Gas de secado	0,2 MPa
Voltaje de Ionización	+ 4,5 kV
Gas nebulizante	4,5 L/min

Tabla 5: Condiciones analíticas.

**

Figura 8:** Cromatogramas SIM de warfarina y cetoprofeno en plasma fortificado. 1: cetoprofeno; 2: Warfarina. Concentración de cada compuesto: 100 ng/mL; volumen de inyección: 10 mL.

MAYI-SCX y SAX

El Shim-pack MAYI-ODS posee una amplia variedad de aplicaciones, como el análisis de drogas, ya que utiliza el ODS como fase estacionaria y puede retener una gran variedad de compuestos en las muestras biológicas. Sin embargo, es difícil retener los compuestos hidrofílicos en el MAYI-ODS, puesto que la retención depende de la interacción hidrofóbica.

El MAYI-SCX y el SAX tienen grupos de intercambio de iones como fase estacionaria en los poros, destinados a atrapar los compuestos hidrofílicos.

El MAYI-SCX se utilizó para el análisis de plasma con contenido de atenorol, que es altamente hidrofílico (1-Octanol / coeficiente de partición de H2O: 0,05). El atenorol se retuvo gracias a su interacción con el grupo sulfonato en el MAYI-SCX. La elución del MAYI-SCX se realizó con ácido acético 0,1% y la separación del resto de los componentes de la matriz se produjo en la columna analítica por medio de una fase móvil de amonio acético. El cromatograma SIM se muestra en la ** Figura 9** ; las condiciones analíticas se muestran en la Tabla 6.

Columna para tratamiento previo	Shim-pack MAYI-SCX (G) (4,6 mm i.d. x 10 mm)
Fase móvil de extracción	0,1% de ácido acético
Caudal	3 mL/min
Temperatura de la columna	40ºC
Volumen de inyección	10 µL
Tiempo de extracción	2 min
Factor de dilución	8
Columna de análisis	Shim-pack VP-ODS (4,6 mm i.d. x 150 mmL)
Fase móvil	A: buffer acetato de amonio 100 mM, pH=4.7 B: acetonitrilo
Programa de gradiente	B 2% (5 min) ® B 35% (14 min) ® B 75% (14,01 min) ® B 75% (18 min)
Caudal	1,0 mL/min
Temperatura de la columna	40ºC
Detección	UV 274 nm

Tabla 6: Condiciones analíticas.

Figura 9: Cromatograma de plasma fortificado con atenorol. 1: Atenorol.

La Figura 10 muestra un cromatograma SIM de antidepresivos tricíclicos presentes en plasma, y las condiciones analíticas se muestran en la Tabla 7.

Columna para tratamiento previo	Shim-pack MAYI-SCX (G) (4,6 mm i.d. x 10 mm)
Fase móvil de extracción	0,1% de ácido acético
caudal	3 mL/min
Temperatura de la columna	40ºC
Volumen de inyección	20 µL
Tiempo de extracción	1 min
Columna de análisis	Gemini C18 (2,0 mm i.d. x 50 mmL)
Fase móvil	A: buffer acetato de amonio 100 mM, pH=5.0 B: acetonitrilo
Programa de gradiente	B 20% (1 min) ® B 90% (4 min)
Caudal	0,5 mL/min
Temperatura de la columna	40ºC
Detección	ESI (LCMS-2010EV)

Tabla 7: Condiciones analíticas.

Figura 10: Cromatogramas SIM de plasma fortificado con 6 drogas. 1: Doxepina (m/z: 280), 2: Desipramina (m/z: 267), 3: Imipramina (m/z: 281), 4: Nortriptylina (m/z: 264), 5: Amitriptylina (m/z: 278), 6: Clomipramina (m/z: 315). Concentración de cada compuesto: 10ng/mL; volumen de inyección: 20 µL.

Estos compuestos pueden atraparse no sólo con el MAYI-ODS, sino también con el MAYI-SCX, debido al propio comportamiento básico del antidepresivo tricíclico.

El MAYI-SAX, que posee una fase estacionaria de trimetilamonio, funciona como una poderosa columna de intercambio de aniones. Para ejemplificar su uso, se analizaron los contenidos de aspirina y de ácido salicílico en plasma con la columna MAYI-SAX (Figura 11). La retención (o elución) de compuestos carboxílicos en el MAYI-SAX depende del pH del solvente de carga, que fluye a través del MAYI-SAX. Se retuvo la aspirina en la columna MAYI-SAX utilizando una solución a pH=4, y se eluyó de la columna una a pH=2.

Figura 11: Cromatograma de plasma fortificado con atenorol. 1: aspirina, 2: ácido salicílico. Concentración de cada compuesto: 10 mg/mL; volumen de inyección: 10 mL.

Conclusión

La serie de columnas Shim-pack MAYI tiene la capacidad de remover proteínas por medio de una técnica de revestimiento única y de materiales de empaque optimizados. El sistema Co-Sense for BA, con las columnas MAYI de tratamiento previo, permite realizar un tratamiento previo de muestras biológicas como el plasma en forma automática, y como resultado también eliminar el trabajo manual que este proceso suele requerir. Las columnas MAYI poseen una amplia variedad de aplicaciones gracias a su versatilidad, su durabilidad, y sus distintas variedades de fase estacionaria. El sistema proporciona una mayor confiabilidad en los resultados de análisis cuantitativos, ya que elimina los errores e inconsistencias que resultan de la preparación manual de las muestras. El sistema Co-Sense for BA es, a todas luces, una poderosa herramienta para el tratamiento previo de muestras biológicas.

Referencias

1. I. H. Hagestam, T. C. Pinkerton, Anal. Chem. 57 (1985) 1757-1763.
2. I. H. Hagestam, T. C. Pinkerton, J. Chromatogr. 351 (1986) 239-248.
3. T.C. Pinkerton, K.A. Koeplinger, Anal. Chem. 62 (1990) 2114-2122.
4. J. Haginaka, N. Yasuda, J. Wakai, H. Matsunaga, H. Yasuda, Y. Kimura, Anal. Chem. 61 (1989) 2445-2448.
5. J. Haginaka, J. Wakai, H. Yasuda, J. Chromatogr. 535 (1990) 163-172.
6. D. J. Gisch, B.T. Hunter, B. T. Feibush, J. Chromatogr. 433 (1988) 264-268.
7. K. Kimata, R. Tsuboi, K. Hosoya, N, Tanaka, T. Araki, J. Chromatogr. 515 (1990) 73-84
8. S. Vielhauer, A. Rudolphi, K. S. Boos, D. Seidel, J. Chromatogr. B 666 (1995) 315-322.
9. E. Yamamoto, K. Murata, Y. Ishihama, N.Asakawa, Anal. Sci. 17 (2001) 1155-1159.
10. S. Kawano, H. Murakita, E. Yamamoto, N. Asakawa, J. Chromatogr. B 792 (2003) 49-54.
11. E.Yamamoto, T.Sakaguchi, T.Kajima, N. Mano, N.Asakawa, J. Chromatogr. B 807 (2004) 327-334.
12. S. Kawano, M. Takahashi, T. Hine, E. Yamamoto, N. Asakawa, Rapid Commun. Mass Spectrom. 19 (2005) 2827-2832.