Persiste la cuestión de si los compuestos sintetizados están verdaderamente siendo detectados. En consecuencia, para abordar esta cuestión se requiere de la aplicación de nueva tecnología vinculada al mismo hardware del LCMS.
Relación entre ionización, polaridad y peso molecular
Para echar luz sobre el problema, concentrémonos en los métodos de ionización utilizados en LCMS. La Figura 1 ilustra la relación entre la polaridad y el peso molecular del analito (compuesto de interés) en un análisis LCMS. El método ideal de ionización dependerá de las propiedades físicas del compuesto a analizar particularmente de la polaridad del compuesto. Como se ve en la Figura 1, existen tres modos de ionización que pueden utilizarse: ionización por electrospray (ESI), química a presión atmosférica (APCI), e ionización fotoinducida a presión atmosférica (APPI) . Los métodos ESI y APCI son los más comunes, utilizados en alrededor del 95% de los análisis LCMS. Desde el punto de vista de la termodinámica, no es arriesgado decir que lo primero en tomar en cuenta al momento de elegir el modo de ionización en LCMS son las propiedades físicas del compuesto. Por ejemplo, el modo APCI no es adecuado para el análisis de compuestos térmicamente inestables.
*Figura 1: * Relación entre polaridad, peso molecular e ionización.
El método de ionización por electrospray (ESI) es apropiado para compuestos de alta polaridad, como productos farmacéuticos y pesticidas; en cambio, el método de ionización química a presión atmosférica (APCI) se ajusta más a los compuestos de polaridad moderada, como esteroides y drogas de baja solubilidad (agentes anticancerígenos, etc.). Si bien existe un gran número de compuestos que puede analizarse utilizando cualquiera de estas técnicas, los iones producidos no son siempre los mismos, lo que complica la interpretación de los datos. Por ejemplo, el método ESI generalmente produce iones [M+H]+ ó [M-H]-, pero ocasionalmente puede producir iones [M+Na]+ ó [2M+Na]+. El método APCI también produce habitualmente iones [M+H]+ ó [M-H]-, pero eventualmente puede producir iones [M+solvente+H]+ ó [M]+, de manera que los iones no siempre se encuentran a la relación masa/carga (m/q) esperada. Predecir el mejor método de ionización para una variedad de muestras puede resultar difícil para quien se encuentre produciendo un número considerable de compuestos.
Para determinar si una reacción produjo el compuesto deseado, debe elegirse la técnica de ionización que mejor se ajuste a ese compuesto. El problema, no obstante, está en cómo determinar qué técnica conviene utilizar, pues los iones que producen son en ocasiones diferentes. El método ESI normalmente produce iones [M+H]+ ó [M-H]-, pero puede producir un aducto de sodio o un ión dímero, obviamente a una diferente relación m/q de la que podría esperarse un ión [M+H]+.
El método APCI también puede producir iones [M+H]+ para muchos compuestos, pero a su vez es capaz de generar aglomerados de iones (clústers) con ciertos solventes, o crear iones a partir de pérdidas neutras en compuestos térmicamente lábiles, como los ácidos carboxílicos generado el ión [M-COOH]-. Queda claro, de este modo, cómo la técnica de ionización utilizada es determinante en la cuestión acerca de la detección de los compuestos sintetizados.
Dificultades en la obtención de datos con dos técnicas en un solo análisis
La clave para resolver este problema consiste en utilizar ambas técnicas en un mismo análisis. Al hacer esto se elimina toda preocupación en cuanto a si los compuestos sintetizados están siendo efectivamente detectados. Al utilizar ambos mecanismos de ionización, primero a través de ESI y luego por APCI para ionizar las demás moléculas, se logra ionizar y por lo tanto también detectar la mayor variedad de compuestos posible. Sin embargo, una mirada atenta a las técnicas ESI y APCI revela que ambas fuentes de iones son diferentes (ver Figura 2). La principal diferencia entre el modo ESI y el APCI radica en el hecho de que hay un calentador en la fuente de iones APCI; en otras palabras, la muestra se calienta en el modo APCI, pero no en el modo ESI. Para poder obtener los datos resultantes de ambas técnicas en un solo análisis, primero es necesario resolver el problema de las diferencias de hardware, que surgen a su vez de la diferencia entre ambas técnicas de ionización.
** Figura 2: ** Mecanismos ESI y APCI * *
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DUIS-2010: fuente de iones dual para análisis simultáneos de tipo ESI y APCI**
La fuente de iones dual DUIS-2010 fue diseñada para superar estos obstáculos en la ionización, esto es, para permitir la obtención de datos con las técnicas ESI y APCI en un solo análisis, y brindar, en consecuencia, la posibilidad de un mayor rendimiento en el desarrollo de síntesis.
Repasemos el diagrama de flujo del proceso de ionización en la DUIS-2010 teniendo en cuenta la Fig. 5.
El eluido de la columna cromatográfica se introduce en la fuente ESI.
La fuente ESI forma un spray, pequeñas gotas de fase móvil que contiene el analito.
Se produce la ionización del analito a medida que el solvente se evapora.
Para secar las gotas se utiliza una contracorriente gaseosa calentada a alta temperatura a través de un bloque metálico.
El spray se volatiliza rápidamente.
Los analitos volatilizados se ionizan a través de los iones del reactivo APCI formados por una descarga del tipo corona.
Los compuestos iónicos formados por ESI y APCI se introducen al MS.
De este modo, un análisis simultáneo resulta perfectamente posible utilizando el DUIS-2010. Además, el instrumento no realiza interrupciones producto de un “switching” entre ambos modos de ionización, de manera que no omite ningún pico y la fuente es compatible con Fast-LC (UFLC).
El DUIS-2010 permite llevar a cabo la ionización de una amplia gama de compuestos, de alta o baja polaridad. También ofrece un intercambio de polaridad positiva/negativa, lo que demuestra su gran valor en aplicaciones tales como la síntesis de componentes múltiples y la evaluación de impurezas. Además, la estructura de la fuente de iones es muy sencilla (ver Fig. 3), lo que facilita su mantenimiento.
** Figura 3: ** Diagrama estructural del DUIS 2010 y foto del interior.
Mayor eficiencia, mayor rendimiento, mayor simplicidad
A continuación presentamos un ejemplo de análisis llevado a cabo utilizando la fuente DUIS-2010. La Figura 4 muestra los cromatogramas de masas obtenidos a partir del análisis de una muestra compuesta por estreptomicina, acetofenona y butilparabeno. Cada uno de los cromatogramas se obtuvo utilizando una fuente de iones distinta. Como puede observarse, para la estreptomicina (pico 1) se logra una excelente respuesta utilizando la fuente de tipo ESI, tal como era de esperarse puesto que produce una molécula protonada. En cambio, utilizando la fuente de tipo APCI, la misma sustancia apenas resulta detectada.
Con respecto a la acetofenona (pico 2), presenta una buena detectabilidad utilizando la fuente APCI, pero no se logra una ionización adecuada con la fuente ESI. En contraste, al utilizar la fuente de iones dual, se obtiene un cromatograma de masas bien balanceado.
Además, realizando análisis de tipo positivo/negativo en forma simultánea, el constituyente que produce la molécula desprotonada butilparabeno (pico 3) también se detecta con claridad.
Por otra parte, la Figura 5 muestra el espectro de masa del butilparabeno, obtenido utilizando ambas fuentes de iones. El butilparabeno genera principalmente una molécula desprotonada tanto con la fuente ESI como con la APCI. Asimismo, con la fuente de iones dual, una molécula desprotonada también es el pico base, de manera que el peso molecular puede verificarse muy fácilmente.
Por lo tanto, queda demostrado el elevado rendimiento de los análisis realizados con el DUIS-2010. El uso de este equipo simplifica la detección LCMS en todos sus aspectos.
Un rendimiento fuera de serie
Hoy en día, junto con un alto rendimiento, de los equipos también se espera una elevada calidad de los análisis. El cromatógrafo líquido Prominence UFLC y la columna de ultra-velocidad y alta resolución XR-ODS, ambos desarrollados por Shimadzu, forman una combinación de hardware y columna que se muestra capaz de satisfacer la demanda de los usuarios en ambos aspectos.
Los niveles de ultra-velocidad, alcanzados en principio para el campo de LC, hoy se han extendido hasta los análisis LCMS. La combinación del Prominence UFLC y la columna XR-ODS con el LCMS-2010EV permiten lograr una velocidad de análisis todavía más alta. Pero sólo la combinación de un sistema HPLC de ultra-velocidad con la capacidad que brinda la fuente DUIS-2010 de realizar una doble ionización simultánea de tipo ESI y APCI, ofrece el máximo rendimiento y sencillez.
La Figura 6 muestra un ejemplo de análisis de alta velocidad de pesticidas tipo N-metil carbamato, y la Figura 7 exhibe los datos de repetibilidad del pesticida tipo metomil. Es evidente que al combinar el LCMS-2010EV con el Prominence UFLC se logra una separación de ultra-velocidad que conserva un grado de exactitud extremadamente alto, con una repetibilidad de área de 1,2%.
Como se describe más arriba, el DUIS-2010 es una fuente de iones que garantiza un alto rendimiento. Ahora bien, si lo que se busca es un rendimiento fuera de serie, no hay nada mejor que combinarlo con los modelos Prominence UFLC y XR-ODS.
*Figura 6: Ejemplo de análisis de alta velocidad de pesticidas tipo N-metil carbamato, combinando el Prominence UFLC con la DUIS-2010.*
*Figura 7: Datos de repetibilidad del pesticida tipo metomil, combinando el Prominence UFLC con la DUIS-2010.*
