La espectrometría de masas ha transformado los análisis cuantitativos y se ha convertido en el método elegido para un enorme número de ensayos. Más recientemente, el método LC-MS/MS ha revolucionado el análisis biológico cuantitativo. Mientras que el filtrado de masas ofrece ventajas sobre las técnicas espectroscópicas, el uso de MS/MS elimina las interferencias y brinda un gran aumento en la selectividad, lo que garantiza a su vez excelentes límites de cuantificación, una muy baja línea de base y un excelente rango dinámico lineal. Como resultado, el experimento de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) realizado con espectrómetros de triple cuadrupolo se ha convertido en la técnica más difundida para la cuantificación de alta sensibilidad y selectividad en matrices biológicas.

En algunos casos, las interferencias no se pueden eliminar utilizando incluso MRM, por lo que se requieren de una cromatografía y una preparación de la muestra más elaboradas. Cuando es imposible eliminar una elevada interferencia matriz o cuando se requieren métodos simples y rápidos de preparación de muestras complejas, se compromete el límite de cuantificación así como la detección de analitos en matrices complejas por la acotada relación señal/ruido generados por los triples cuadrupolos en modo MRM convencional. En esos casos, una tercera instancia MS (MRM³) ha demostrado la capacidad de incrementar significativamente la selectividad y eliminar los inconvenientes de interferencia matriz. El resultado es un límite de cuantificación más bajo y una mejora en el trazado de los picos.

Un análisis LC-MS/MS/MS (en modo MRM³) con la sensibilidad deseada requiere un instrumento con tres características fundamentales: la capacidad de llevar adelante experimentos MS/MS/MS muy rápidamente, que conlleva a una sensibilidad ultra-elevada para superar la caída en la abundancia de iones debida al número de instancias de fragmentación, y una gran velocidad de barrido para mantener el ritmo del LC (más especialmente cuando se trata de UHPLC). Estos requisitos han sido difíciles de alcanzar con resultados similares al modo MRM, hasta el desarrollo del sistema LC-MS/MS QTRAP® 5500.

Características fundamentales del sistema QTRAP® 5500

• Cuantificación MRM³ – En el sistema QTRAP® 5500, un barrido MS/MS/MS se completa con un tiempo de ciclo veloz y utilizando un estrecho rango centrado alrededor de la segunda generación de iones producto para cuantificación. Este tipo de barrido es conocido como MRM³ (Figura 1).

• Mayor velocidad de barrido en la trampa de iones – La velocidad de hasta 20.000 Da/seg permite barridos MRM³ con un tiempo de ciclo compatible con HPLC, de modo tal que los iones extraídos del cromatograma (XICs) con iones producto de segunda generación (MRM³) pueden ser extraídos e integrados con un número suficiente de mediciones a fin de definir correctamente (15 puntos) los picos cromatográficos.
• Mejoramiento de la fragmentación dentro de la trampa – La nueva Trampa Lineal Accelerator™ con válvula de gas pulsado implementada en el sistema QTRAP® 5500 garantiza una fragmentación dentro de la trampa más veloz y eficiente (Figura 2).

• Trampa de iones de máxima sensibilidad – El sistema QTRAP® 5500 cuenta con la trampa de iones de mayor sensibilidad en el mercado.
• Alta selectividad – La elección de un ión precursor en Q1, seguido de una primer fragmentación en Q2, para luego ser aislado un Segundo ión a fragmentar dentro de la Trampa Lineal (Q3), convierte al experimento MRM³ en una herramienta muy poderosa de selectividad. (Figura 3).

Velocidad

El sistema QTRAP® 5500 también ha mejorado significativamente la velocidad y eficiencia de la fragmentación en la trampa de iones. El gas de colisión ahora es introducido a través de una válvula de gas pulsado de alta velocidad que permite un rápido incremento de la presión en la trampa de iones (Figura 2). Junto con una mejora en la variación de la frecuencia RF, el resultado es una mayor eficiencia de fragmentación y un menor tiempo de excitación (<25 mseg).

Además, gracias al uso de electrónica eQ™, la velocidad de barrido de la trampa de iones lineal alcanza un máximo de 20.000 Da/seg. Esto permite acelerar el barrido MRM³ con máxima sensibilidad.

Selectividad

La combinación de características del sistema QTRAP® 5500 brinda una selectividad del más alto nivel. El ión analito de interés es aislado en el Q1 con una resolución seleccionada por el usuario (normalmente 0,7 Da de FWHM). Luego es fragmentado en la celda de colisión Q2, dando como resultado un amplio rango de iones producto para la selección de la trampa de iones.

La fragmentación dentro de la trampa se logra gracias a la aplicación de una banda de excitación angosta a una longitud de onda simple. Como se ve en la Figura 3, esto permite una fragmentación muy selectiva. El isótopo C12 de un ión producto puede ser específicamente excitado y fragmentado del todo causando mínima fragmentación del isótopo C13. Esto provee mayores ventajas al eliminar la interferencia del ruido de fondo. La combinación de estas características garantiza una selectividad y una flexibilidad sin precedentes en el diseño de experimentos óptimos de cuantificación MRM³.

Sensibilidad

La tecnología de la Trampa Lineal Accelerator™ ha resultado en un mejoramiento revolucionario del manejo de los iones al interior de la trampa del sistema QTRAP® 5500, lo que permite obtener una sensibilidad 100 veces mayor. Los iones son manipulados dentro de la trampa utilizando campos auxiliares de corriente continua, obtenidos gracias a pequeños electrodos (Figura 4, arriba). Un voltaje aplicado al cuello de la trampa permite moverlos hacia la región de extracción durante el período de enfriamiento. Aumentando el potencial en los electrodos auxiliares justo antes del barrido, se crea una barrera potencial para completar el proceso de concentración de iones. La aplicación de este campo axial tiene un efecto significativo en la sensibilidad (Figura 4, abajo izquierda).

Además, se aplica una frecuencia de radio al lente de salida de la trampa, lo que aumenta todavía más la sensibilidad (Figura 4, abajo derecha). Estas dos innovaciones permiten obtener una resolución mejorada a la unidad en los modos de barrido de la trampa a esta misma velocidad.

Eliminación de interferencias

Las innovaciones en la velocidad de análisis, en la selectividad y en la sensibilidad del sistema QTRAP® 5500 permiten una exitosa implementación del esquema de trabajo MRM³ en un amplio rango de analitos. Algunas veces el ruido de fondo o las interferencias pueden limitar la detección de un analito. En la Figura 5 se muestra como ejemplo una interferencia con una transición MRM igual a la del Clenbuterol, con el mismo tiempo de retención. Utilizando MRM³ es posible eliminar por completo esta interferencia.

Conclusiones

• MRM³ es una estrategia eficaz para la cuantificación de analitos cuando el ruido de fondo o las interferencias dificultan la cuantificación MRM convencional (Figura 5).

• MRM³ puede ser utilizada para obtener un límite de cuantificación similar con menor preparación de las muestras y una cromatografía más simple y veloz.
• MRM³ ha sido aplicada con éxito a la detección y cuantificación de pequeñas moléculas, péptidos y biomarcadores proteicos.
• MRM³ mejora significativamente en el sistema QTRAP® 5500, haciendo de éste una herramienta muy útil para la cuantificación de matrices complejas.
• El QTRAP® 5500 es el sistema LC-MS/MS de triple cuadrupolo y trampa de iones lineal de mayor performance en el mercado. Brinda a los usuarios múltiples y poderosas herramientas cuantitativas y cualitativas.

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