En este artículo se discute el uso de cromatografía de gases rápida utilizando columnas narrow-bore (GC) combinada con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo de barrido rápido (qMS) en el análisis de muestras de sabores y fragancias (F&F). La identificación de las muestras y de los picos se realizó con el apoyo de dos bibliotecas MS. La primera contenía espectros puros específicos, relativos a las fracciones volátiles de F&F. Cada espectro de F&F se obtuvo mediante un análisis GC-MS. Una vez identificado el sabor o fragancia, se utilizó la segunda biblioteca MS: se identificó cada pico en base a los datos de similitud de espectro y de índice de retención lineal. El método fue sujeto a validación.

El uso de GC-MS es habitual en el campo del análisis de sabores y fragancias. Se trata de una herramienta valiosa que puede considerarse como una tecnología bidimensional: la dimensión de separación abastece de fracciones de muestra al MS, que las somete a fragmentación (normalmente mediante ionización por impacto de electrones) y luego separa los iones generados en base a su relación m/z.

PUNTOS CLAVE

• Se ha desarrollado una novedosa biblioteca (EI-MS F&F) de espectros GC-MS relativos a huellas digitales de sabores y fragancias.
• El registro de los espectros se realizó mediante GC-qMS rápido, con una columna narrow-bore, en un tiempo promedio de análisis de 10 min.
• A la búsqueda en biblioteca le siguió un proceso de identificación pico por pico con una segunda biblioteca con información sobre índices de retención lineal LRI (FFNSC 1.4).
• El método analítico desarrollado demuestra una alta capacidad de reconocimiento de huellas digitales específicas de aceites esenciales.
• La combinación del método GC-MS rápido con el doble uso de las bibliotecas puede considerarse una herramienta útil y eficaz para un rápido control de calidad de sabores y fragancias.

El análisis de una muestra desconocida de un sabor o fragancia es una tarea compleja, que normalmente consta de dos niveles de identificación: (1) la muestra debe ser correctamente identificada a nivel mezcla; (2) los componentes individuales de la muestra deben ser correctamente identificados a nivel molecular. Considerando la primera etapa, un modo de identificar un sabor o fragancia desconocida es introduciendo la muestra directamente en la fuente de iones del MS, e identificar el espectro obtenido en forma directa o bien realizar una búsqueda en biblioteca. Dependiendo de su grado de volatilidad, las muestras pueden introducirse en la fuente de iones mediante una sonda de inserción directa, una sonda de exposición directa, o un reservorio calentado.¹ Una vez identificado el sabor o fragancia, se pasa a la segunda etapa, generalmente alcanzada mediante GC-EI-MS. En los análisis contemporáneos se utilizan fases estacionarias de distinta polaridad, mientras que la identificación suele realizarse aprovechando los espectros MS y calculando los índices de retención lineal (LRI).² En una investigación anterior se ha desarrollado una novedosa biblioteca MS de doble filtro, y se ha aplicado al análisis de elementos volátiles de sabores y fragancias.^3,4

El doble filtro opera del siguiente modo: al final del análisis, el software GC–MS calcula automáticamente los valores LRI de cada pico. Durante el proceso de búsqueda en biblioteca, el mismo software suprimió coincidencias con un LRI de referencia, con respecto al de la incógnita, fuera de un rango predefinido de LRI (p.ej. ±5 unidades). Esto depende del tipo de fase estacionaria utilizada: las fases apolares se caracterizan por una menor variación de LRI en comparación con las polares. Los valores LRI contenidos en la biblioteca se obtuvieron de un análisis GC–MS llevado a cabo con una columna de 30 m × 0,25 mm (d.i.), con un espesor de film de 0,25 µm (5% difenil + 95% polidimetilsiloxano).

La presente investigación se propone cuatro objetivos principales: (1) desarrollar y validar un método GC–EI-MS veloz, utilizando una columna capilar apolar y narrow-bore 10 m × 0,1 mm (d.i.), para el análisis de muestras de sabores y fragancias; (2) evaluar la efectividad de la biblioteca MS de doble filtro en las condiciones GC–EI-MS desarrolladas. Se puso especial atención en la definición de una ventana LRI para análisis GC–EI-MS veloz, utilizando una columna de polímero de silfenileno (de polaridad equivalente a una fase 5% difenil + 95% polidimetilsiloxano); (3) desarrollar una biblioteca GC–EI-MS de sabores y fragancias para la identificación de muestras desconocidas a nivel mezcla. La biblioteca se construyó aplicando el método GC–EI-MS desarrollado a muestras genuinas y luego derivando un único espectro promedio que abarcó todos los picos en el rango de tiempo de detección. El espectro obtenido puede ser tenido como huella digital de la muestra, y es en general comparable a un análisis EI-MS directo; (4) evaluar el método GC–EI-MS combinado con las dos bibliotecas MS para un control de calidad rápido de muestras de sabores y fragancias.

Muestras y preparación

Las muestras de aceites esenciales fueron provistas por Citrus Vita (Pace del Mela, Messina, Italia), Simone Gatto (San Pier Niceto, Messina, Italia) y Dr Pappas (Essential Oil University, New Albany, EEUU). Todas ellas fueron almacenadas a 4°C. Antes del análisis, se diluyó cada aceite al 1:10 (v/v) en n-hexano.

Los alcanos C7-C30 y los compuestos estándar puros listados en la Tabla 1 fueron provistos por Sigma-Aldrich. Se preparó una solución C7-C30  100 ppm en n-hexano.

Condiciones de operación GC-MS

Todas las aplicaciones GC-MS se llevaron a cabo en un modelo de Shimadzu GCMS-QP2010 Plus, equipado con un muestreador automático AOC-20s y un inyector automático AOC-20i.

GC-MS rápido: Se utilizó una columna SLB-5ms, de 10 m × 0,10 mm (d.i.) × 0,10 µm de espesor de film (polímero silfenileno), provista por Supelco. El programa de temperatura utilizado fue de 50-250°C a 10°C/min; como gas portador se utilizó helio a una presión inicial de 343,2 kPa (modo de velocidad lineal constante: 50 cm/s). Volumen de la muestra: 0,5 µL; factor de separación: 400:1.

GC-MS convencional: Se utilizó una columna SLB-5ms, de 30 m × 0,25 mm (d.i.) × 0,25 µm de espesor de film, también provista por Supelco. El programa de temperatura utilizado fue de 50-250°C a 3°C/min; el gas portador fue helio a una presión inicial de 32,0 kPa (modo de velocidad lineal constante: 30,8 cm/s). Volumen de la muestra: 1 µL; factor de separación: 100:1.

Parámetros MS: La muestra se analizó en modo “full scan”, con una velocidad de barrido de 3333 amu/seg, un rango de masa de 40-350 m/z, y una frecuencia de muestreo de 10 espectros/seg, en condiciones GC-MS rápido. En condiciones GC-MS convencional, se aplicó una velocidad de barrido de 700 amu/seg, un rango de masa de 40-350 m/z, y una frecuencia de muestreo de 2 espectros/seg. Las temperaturas de la interfaz y de la fuente de iones fueron 250°C y 200°C, respectivamente.

Modo de ionización MS: Ionización de electrones (EI); voltaje del detector: 1,0 kV. Los datos fueron recogidos con el software GCMSsolution (Shimadzu). Las bibliotecas MS utilizadas para la comparación de los espectros fueron la EI-MS F&F y la FFSNC 1.4 (Chromaleont, Messina, Italia).

Resultados y discusión

En el campo de GC rápida con salida a vacío, es bien sabido que el uso de columnas capilares cortas y mega-bore es una opción atractiva para un análisis rápido de muestras de poca complejidad; de hecho, las condiciones de baja presión se extienden a través de todo el largo de la columna, el coeficiente de difusión del gas analito se incrementa, y por lo tanto la velocidad lineal óptima es mayor. La literatura sobre el tema muestra separaciones GC-MS muy rápidas.^5-7 Sin embargo, el uso de columnas mega-bore en experimentos GC-MS rápido no es aconsejable en análisis de matrices de mayor complejidad, como lo son las de sabores y fragancias. En esta situación es más conveniente utilizar columnas narrow-bore, pues ofrecen un número de platos teóricos mucho más alto. En GC capilar, una reducción del diámetro interno permite un aumento sustancial de la eficiencia de la columna: para columnas con una alta relación de fase, el valor de H mínimo se aproxima al diámetro interno de la columna. En consecuencia, una columna capilar narrow-bore de 10 m × 0,10 mm (d.i.) × 0,10 µm genera el mismo número de platos teóricos (100.000) que una de 25 m × 0,25 mm (d.i.) × 0,25 µm, si ambas operan en condiciones óptimas. Además, la porción ascendente de la curva Golay de una columna capilar narrow-bore crece muy gradualmente, y por tanto puede aplicarse una velocidad de gas mayor con muy poca pérdida de eficiencia de la columna. Finalmente, la velocidad lineal óptima para cada columna aumenta con una reducción del diámetro interno; en consecuencia, las columnas cortas y narrow-bore permiten un análisis GC rápido y ofrecen resultados perfectamente comparables a los que se obtienen  de los experimentos GC convencionales en términos de resolución.^8-13

Figura 1: Cromatograma GC–qMS rápido TIC de aceite esencial de limón. Identidad de los picos: 1) ?-thujene; 2) ?-pinene; 3) camphene; 4) sabinene; 5) ?-pinene; 6) myrcene; 7) octanal; 8) ?-phellandrene; 9) ?-terpinene; 10) p-cymene; 11) limonene; 12) ?-ocimene (Z); 13) ?-ocimene (E); 14) ?-terpinene; 15) cis-sabinene hydrate; 16) terpinolene; 17) linalool; 18) trans-sabinene hydrate; 19) nonanal; 20) camphor; 21) citronellal; 22) terpinen-4-ol; 23) ?-terpineol; 24) decanal; 25) nerol; 26) neral; 27) geranial; 28) perillaldehyde; 29) undecanal; 30) citronellyl acetate; 31) neryl acetate; 32) geranyl acetate; 33) ?-bergamotene cis; 34) caryophyllene (E); 35) ?-bergamotene trans; 36) ?-farnesene (Z); 37) ?-farnesene (E); 38) ?-santalene; 39) bicyclogermacrene; 40) ?-bisabolene; 41) ?-bisabolene.

El método GC que aquí se describe es relativamente rápido: se aplicó una velocidad óptima constante de He de 50 cm/s, con un gradiente de temperatura lineal de 10°C/min. En primer lugar se realizó un análisis rápido de una mezcla de alcanos C7-C30, para el cálculo del LRI. Luego se analizó un aceite esencial de limón genuino: en la Figura 1 se reporta un cromatograma TIC GC-qMS con un tiempo de corrida menor a 9 minutos (aproximadamente 5 veces más rápido que un experimento GC-MS convencional).

Los picos fueron bastante anchos para ?-thujene (tR = 1,778 min), terpinolene (tR = 3,516 min) y geranyl acetate (tR = 7,341 min) con valores de 1,8 s, 2,4 s y 2,7 s, respectivamente. La frecuencia de muestreo de 10 Hz del qMS de barrido rápido generó un número de espectros por pico suficiente para una reconstrucción adecuada. Además, los perfiles de los espectros resultaron consistentes con cada pico, y no se observaron picos torcidos. Se identificaron 41 elementos volátiles conocidos del aceite de limón (ver Figura 1) utilizando la biblioteca MS de doble filtro FFNSC, construida en base a análisis GC-qMS convencionales. El primer filtro eliminó posibles coincidencias con una similitud espectral menor al 90%. Para el segundo filtro se aplicó una ventana LRI inicial amplia (±20 unidades), para evaluar las diferencias entre los valores del experimento (automáticamente calculados por el software GC-qMS) y los valores de la biblioteca. En un análisis GC-qMS convencional, utilizando la misma fase estacionaria de columna narrow-bore, normalmente se utiliza una ventana LRI de ±5 unidades. En los análisis GC-qMS rápidos, se observó que una ventana de ±5 unidades habría sido suficiente para casi todos los compuestos identificados, excepto octil-acetato (+9 unidades), cariofilena (E) (–9 unidades), y biciclogermacrena (–6 unidades). Entonces se concluyó que un rango LRI de ±10 unidades sería apropiado para el análisis de los seis tipos de aceites esenciales adicionales: mandarina verde, mandarina amarilla, mandarina roja, bergamota, naranja dulce y naranja ácida. Cada aceite cítrico fue sometido a cinco experimentos GC-MS rápidos, el mismo día y a lo largo de cinco días consecutivos; antes de cada aplicación se analizó la mezcla de alcanos C7-C30. Los resultados finales indicaron que el rango LRI de ±10 unidades era apropiado para el método GC-qMS rápido; sin embargo, sería más recomendable un rango ampliado de ±15 unidades, ya que algunos analitos fueron caracterizados con una diferencia de ±10 con respecto al valor de la biblioteca. En base a experiencias pasadas, la diferencia entre el valor LRI de un análisis GC convencional y de uno rápido tiende a ser más importante cuando la diferencia entre el tiempo total de uno y otro aumenta. Por lo tanto, la ventana de ±15 unidades utilizada es válida para el método GC-qMS aquí desarrollado; un rango más amplio (p. ej. ±20, ±25, etc.) sólo sería necesario para experimentos GC-qMS aún más rápidos.

El método Fast GC-qMS fue sometido a validación, usando aceite de limón, en términos de precisión intra- e inter-día de los tiempos de retención y de las áreas % de picos. Los valores de CV% para 10 compuestos del aceite de limón (picos 1, 3, 5, 9, 13, 14, 16, 23, 27 y 31) nunca fueron superiores a 0,2% (intra-día) y 0,3% (inter-día) para la precisión de tR, y siempre menores a 9,8% (intra-día) y 10,6% (inter-día) para la repetibilidad de las áreas % de picos. Los valores intra- e inter-día de LRI también fueron muy estables: una serie de alcanos C7-C30 fue analizada antes que el aceite esencial de limón: el procedimiento fue repetido 5 veces en un mismo día y en 5 días separados. Ningún valor de CV% de LRI. Relativo a los mismos 10 picos, superó el 0,2%. Finalmente, el valor de concentración mínima al que los 10 compuestos (analizados como estándares puros) fueron identificados con una similitud MS mínima de 90% (n=10) fue 10 ppm, excepto el ?-terpineno, que fue identificado con una similitud de 90% a niveles de 5 ppm.

Figura 2: Resultado de la biblioteca EI-MS F&F: el espectro experimental es el de arriba.

En este punto, el mismo método GC-qMS rápido se utilizó para construir otra biblioteca MS llamada EI-MS F&F. Hasta hoy, aproximadamente 200 aceites esenciales genuinos han sido sujetos a GC-qMS rápido, y un espectro único derivado de cada cromatograma ha sido añadido a la biblioteca. El procedimiento para la construcción de la biblioteca EI-MS F&F está basado en el promedio de los espectros relativos a todos los picos del cromatograma, del primero al último, sin incluir el solvente. No se extrajo el espectro promedio de la línea de base, puesto que sería extremadamente difícil obtener uno que fuera relativo a la totalidad del rango de elución del cromatograma. Aunque no se realice una comparación directa entre ambas metodologías, cada espectro EI-MS F&F puede ser considerado equivalente a uno de inyección directa MS. Es evidente que la biblioteca EI-MS F&F puede identificar con exactitud una muestra desconocida, pero no sus constituyentes (la capacidad de este enfoque para tratar con la variación natural de la composición será tratada más adelante). Los aceites esenciales analizados se diluyeron al 1:10 (v/v) en n-hexano, inyectados en un volumen de 0,5 µL, con un factor de separación de 400:1. Utilizando esta nueva biblioteca, se aplicó un filtro de similitud de 90%, mientras que obviamente no fue posible aplicar un filtro LRI. Para poner a prueba la biblioteca EI-MS F&F, se analizaron 10 muestras ciegas provistas por diferentes fabricantes de aceites esenciales; todas fueron correctamente identificadas, con una similitud en ningún caso menor al 96%. Un ejemplo se muestra en la Figura 2: el espectro promedio fue sujeto a búsqueda en la biblioteca, y el aceite desconocido fue identificado como aceite de geranio ( Pelargonium roseum ) con una coincidencia de 98%.

Figura 3: a) Cromatograma GC-qMS TIC rápido de una muestra desconocida de sabor o fragancia; b) Resultado en la biblioteca EI-MS F&F.

En este punto se realizó la evaluación de la metodología GC-qMS rápida combinada con las bibliotecas FFNSC y EI-MS F&F. Otra de las 10 muestras ciegas fue sujeta a reconocimiento; el cromatograma GC-qMS rápido correspondiente se muestra en la Figura 3a.

La búsqueda en biblioteca EI-MS F&F arrojó una similitud espectral de 100% con respecto a aceite de mandarina verde (Figura 3b). Sin embargo, como se puede ver, en la lista aparecieron diferentes aceites producidos en diferentes cosechas. En este caso particular, el correcto era el primero en la lista, pero en otros casos no se pudo distinguir entre aceites producidos en diferentes períodos. Además, en la lista también aparecieron aceites de mandarina amarilla y roja, también con excelente similitud; por ende, se concluyó que la biblioteca EI-MS F&F no es capaz de distinguir entre aceites de mandarina verde, amarilla y roja. No obstante, una evaluación cuidadosa de los componentes objetivos puede ser de gran ayuda para diferenciar las muestras de aceites de mandarina. Por ejemplo, es sabido que el contenido de limoneno aumenta a lo largo de la temporada, entre un valos promedio de 68% y 74%. Del mismo modo, van decreciendo ciertos hidrocarburos monoterpenos (?-terpineno, ?-pineno, ?-pineno), los hidrocarburos sesquiterpenos y los compuestos oxigenados.¹⁴

El cromatograma de aceite de mandarina verde fue luego sujeto a un reconocimiento pico a pico, con un total de 34 compuestos identificados (Tabla 1).

Tabla 1: Elementos volátiles del aceite de mandarina verde, identificados mediante GC–qMS rápido y convencional; valores LRI de la biblioteca, rápido y convencional; valores porcentuales de similitud MS, rápido y convencional.

Con respecto a los valores LRI (se utilizó una ventana de ±15), se observó una diferencia máxima de +10 y –10 uindades para limoneno y ?-selineno, respectivamente. Además, se observó una desviación promedio de 3,3 unidades con respecto al valor de la biblioteca. Considerando la calidad espectral, se identificaron 14 componentes de mandarina (41%) con una similitud MS mayor al 95%. Luego se compararon los resultados de la identificación pico a pico con los que se obtienen de un experimento GC-qMS convencional optimizado sobre aceite de mandarina. El tiempo total de análisis fue más de 5 veces mayor (50 min) y, según lo esperado, el mayor poder de resolución de una columna capilar de 30 m × 0.25 mm i.d. (aproximadamente 120.000 N) permitió la separación e identificación de un mayor número de compuestos, exactamente 41 (Tabla 1). Con respecto a los valores LRI (se utilizó una ventana de ±5), se observó una diferencia máxima de 10 unidades para diversos terpenos, con lo cual sería recomendable utilizar una ventana más grande. Mejoró la desviación promedio con respecto a los LRI de la biblioteca, con un valor de 1,6. La calidad espectral fue muy alta, con 31 elementos volátiles (~76%) identificados con una similitud MS mayor al 95%. Esta mejora en la aplicación convencional sin duda se debe al incremento en la eficiencia de la columna. Finalmente, se derive un espectro promedio del cromatograma GC-qMS convencional, que fue sujeto a una búsqueda en la biblioteca EI-MS F&F: se obtuvieron coincidencias con similitudes de 94% y 93% para aceites de mandarina amarilla y roja, respectivamente. Luego se llevaron a cabo más búsquedas sobre otros cromatogramas GC-qMS convencionales, y se concluyó que, si bien se puede utilizar la biblioteca EI-MS F&F en análisis convencionales, los mejores resultados se obtienen con la metodología GC-qMS rápida.

Conclusiones

Los resultados obtenidos a raíz de esta investigación ciertamente pueden considerarse como una contribución positiva al campo de sabores y fragancias; de hecho, el proceso escalonado que se propone permite llevar a cabo una rápida identificación y evaluación de matrices desconocidas. La biblioteca GC–EI-MS de sabores y fragancias, todavía en continuo crecimiento, es sin lugar a dudas una herramienta promisoria. Además, la biblioteca MS de doble filtro, en principio desarrollada para análisis GC–qMS convencionales, demuestra ser conveniente también para el nuevo método validado. El uso de ambas bibloiotecas, en combinación con el método rápido, ofrece resultados analíticos confiables en menos de una hora, incluyendo la preparación de la muestra, la mezcla de los alcanos y el mismo análisis GC–qMS.

Futuras investigaciones se dedicarán al desarrollo de otras bibliotecas MS igualmente específicas, para ser utilizadas en análisis GC–qMS monodimensionales y bidimensionales.

Referencias

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