Esta nota presenta un ejemplo de desarrollo rápido y simple de tres métodos LC-MS/MS para el monitoreo de plaguicidas, incluyendo un total de 159 plaguicidas contemplados en la más reciente regulación japonesa para el testeo de alimentos1. Todos los métodos se generaron utilizando el catálogo MRM de plaguicidas del software Cliquid para alimentos y bebidas. Se comprobó el éxito de todos ellos en el análisis de plaguicidas presentes en diferentes productos alimenticios.
Las regulaciones más recientes para el análisis de alimentos y medioambiental, especialmente en Europa y en Asia, exigen el monitoreo de residuos de plaguicidas utilizando técnicas de confirmación tales como GC-MS o LC-MS/MS. Actualmente se utilizan en todo el mundo más de 1000 plaguicidas diferentes que luego sus residuos continúan presentes en los alimentos y en el medio ambiente, junto con sus metabolitos y subproductos de degradación. En consecuencia, existe una fuerte demanda de un método analítico poderoso, rápido, y sobre todo capaz de detectar la presencia de plaguicidas en concentraciones extremadamente bajas.
En Alder et al. se compara el uso de GC-MS y LC-MS/MS en análisis de múltiples residuos de plaguicidas, y se concluye que “…los beneficios de LC-MS/MS en términos de mayor alcance, mayor sensibilidad y mejor selectividad son evidentes.”2.
Sin embargo, no existe hoy en día una técnica analítica capaz de detectar todos los plaguicidas utilizando un único método. Aquí es donde el software Cliquid ofrece una manera fácil de personalizar los métodos de monitoreo de múltiples residuos o potenciales contaminantes. Contiene un catálogo MRM con más de 600 compuestos que permite desarrollar métodos LC-MS/MS con rapidez. Este catálogo incluye nombres e información sobre los compuestos, transiciones MRM optimizadas y parámetros dependientes de los compuestos, junto con los tiempos de retención. A su vez, una biblioteca de espectros de Iones Producto es usada por Cliquid**® ** para poder confirmar definitivamente todo analito presuntivo por comparación de espectros de Iones Producto. También puede ajustarse y ser extendido fácilmente con nuevos compuestos y más parámetros.
Químicos y muestras
Los estándares de plaguicidas utilizados para armar el catálogo MRM se obtuvieron en su máxima pureza de Sigma Aldrich (PESTANAL, estándar analítico) y Wako Pure Chemical Industries (para el análisis de residuos). Los solventes y buffers se obtuvieron de Sigma Aldrich (grado LC-MS).
Las muestras de frutas y vegetales (banana, damasco, frutilla, kiwi, limón, manzana, naranja, pasas, pepino, pera, pimienta, pomelo, té, tomate y uva) se compraron en un supermercado local.
Preparación de las muestras
Para la extracción de las muestras de frutas y vegetales se utilizó una variante del procedimiento QuEChERS (“Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe”)3-5.
Separación HPLC
Se utilizó un sistema LC Shimadzu Prominence, conformado por un controlador de sistema (CBM-20A), dos bombas (LC-20AD) con mezclador de gradiente semi-micro, un degasificador (DGU-20A3), un muestreador automático (SIL-AC), y un horno de columnas (CTO-20AC). La separación se efectuó usando elución por gradientes en una columna Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP 80A 50x2mm con un solución acuosa de formiato de amonio 5mM (A) y CH3OH + formiato de amonio 5mM (B). Las condiciones del gradiente se muestran en la Tabla 1. La temperatura del horno se fijó en 25ºC. Se utilizó un volumen de inyección de 20 µL.
| Step T | Time (min) | Flow rate (µL/min) | A (%) | B (%) |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 5.0 | 250 | 80 | 20 |
| 1 | 8.0 | 250 | 10 | 90 |
| 2 | 14.0 | 250 | 10 | 90 |
| 3 | 15.0 | 250 | 80 | 20 |
TABLA 1. Gradiente LC con H2O + 5 mm formiato de amonio (A) y CH3OH + 5mM formiato de amonio (B)
Detección MS
Se utilizó un sistema LC/MS/MS QTRAP® 3200 (híbrido de triple cuadrupolo y trampa de iones lineal) junto con una fuente de iones TurboV™ y una sonda de ionización por electrospray (ESI). El espectrómetro de masas se operó en modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Este modo MRM permitió cuantificar los compuestos objetivo con la más alta selectividad y sensibilidad, monitoreando la transición del ión precursor (filtrado en el Q1) al ión producto (generado en la celda de colisión del Q2 y filtrado en el Q3). Se realizó un análisis de primera confirmación basado en la proporción de dos transiciones MRM detectadas para cada analito. A su vez, cada plaguicida que supera esta primer confirmación con una señal umbral por encima de un valor previamente establecido por el usuario con Cliquid, es sometido a una segunda y definitiva confirmación por comparación de Espectros Iones Producto con la Biblioteca Espectral comercial de ABSCIEX de más de 600 plaguicidas, que se enriquece día a día por el aporte de los usuario y que puede actualizar cada uno desde www.absciex.com, con sólo registrarse con el número de serie del instrumento. Esta excelente y única posibilidad de confirmación sólo es posible con tecnología QTRAP.
Software Cliquid para alimentos y bebidas
Se utilizó el software Cliquid para desarrollar los métodos LC-MS/MS, analizar las muestras y automáticamente generar reportes.
El software Cliquid para alimentos y bebidas fue específicamente diseñado para facilitar el uso de tecnología LC-MS/MS en laboratorios de testeo de alimentos de rutina. Simplifica la operación de un sistema LC-MS/MS utilizando pruebas preconfiguradas, un sencillo “wizard” de cuatro pasos para configurar el análisis, y generando reportes en forma automática. Además, ofrece un catálogo MRM con más de 500 plaguicidas para el desarrollo rápido de métodos.6
El catálogo MRM del software Cliquid se utilizó para desarrollar los siguientes métodos de residuos múltiples, que coinciden con los de la Japanese Positive * List* 1. En todos los plaguicidas se detectaron dos transiciones MRM. Los dwell times fueron ajustados automáticamente por Cliquid® dependiendo del número de compuestos monitoreados de modo de colectar suficientes puntos de datos a lo largo de los picos cromatográficos. Los parámetros LC-MS/MS completos están disponibles en la documentación de métodos incorporada al software Cliquid .
Figura 1. Captura de pantalla de Software Cliquid ® que muestra el asistente de prueba del catálogo MRM
Resultados y discusión
En las Fig. 2-4 se muestran cromatogramas estándar de todos los métodos desarrollados para ilustrar la separación cromatográfica y la detección por espectrometría de masas utilizando ionización por electrospray en polaridad positiva y negativa respectivamente. Para realizar la cuantificación y la confirmación, se monitorearon 2 transiciones MRM. La celda de colisión LINAC del sistema QTRAP® 3200 permite detectar todas las transiciones MRM en una sola ventana, con un tiempo de lectura breve (5-50 ms) y sin sacrificar sensibilidad.
Figura 2. Cromatograma LC / MS / MS de 101 plaguicidas del método Japanese Positive List I en polaridad positiva
Figura 3. Cromatograma LC / MS / MS de 18 pesticidas del método Japanese Positive List II en polaridad negativa
Figura 4. Cromatograma LC / MS / MS de 43 pesticidas del método Japanese Positive List II en polaridad positiva
Utilizando los métodos LC-MS/MS desarrollados con el catálogo MRM del Cliquid, se pudo detectar la mayoría de los plaguicidas en una concentración por debajo de 1 ng/mL, y la totalidad de ellos en una concentración de 5 ng/mL. En la Fig. 5 se muestran distintos cromatogramas donde se destaca la sensibilidad superior del sistema QTRAP® 3200.
Figura 5. La sensibilidad de los plaguicidas seleccionados detectado por LC / MS / MS en una concentración de 10ng/mL
Los valores de los límites de detección en la Tabla 2 demuestran que los métodos LC-MS/MS desarrollados garantizan una sensibilidad suficiente para un testeo de plaguicidas al nivel de 10 µg/kg en muestras de alimentos. El rango lineal, determinado en base a la exactitud entre 85% y 115% con regresión lineal y la función 1/x, fue de 2,5 a 3,5 órdenes de magnitud a partir del LOD para cada analito.
| Pesticide | LOD (ng/mL) | Pesticide | LOD (ng/mL) |
|---|---|---|---|
| Aldicarb | 0.05 | Azoxystrobin | 0.04 |
| Bendiocarb | 0.33 | Carbaryl | 0.23 |
| Carbofuran | 0.04 | Dimethomorph | 0.12 |
| Diuron | 0.19 | Flufenacet | 0.10 |
| Fluroxypyr | 1.76 | Imazalil | 0.16 |
| Imazaquin | 0.13 | Imidacloprid | 0.18 |
| Lufenuron | 0.09 | Methiocarb | 0.08 |
| Methomyl | 0.19 | Thiabendazole | 0.11 |
TABLA 2. Límites de detección (LOD S / N = 3)
La desviación estándar en la relación de cuantificación y cualificación en transiciones MRM fue típicamente entre ±15%.
Los métodos LC-MS/MS desarrollados se utilizaron para monitorear plaguicidas en diversas muestras de frutas y vegetales luego de una extracción QuEChERS. Las Fig. 6-8 muestran reportes del análisis de diferentes muestras seleccionadas a modo de ejemplo.
Figura 6. Informe (parcial) de resultado positivo de imazalil (317µg/kg) y Tiabendazol (13.2µg/kg) en una muestra de pomelo incluyendo una tabla de resultados con confirmación MRM positiva (izquierda) y cromatogramas (derecha)
Figura 7. Informe (parcial) de resultado positivo del metomil (1.9µg/kg) en una muestra de uva incluyendo una tabla de resultados (a la izquierda) y cromatogramas (derecha), este hallazgo fue descontado sobre la base de una relación de MRM incorrecta
Figura 8. Informe del resultado positivo de Dimetomorf (23.3µg/kg) e imazalil (274µg/kg) en una muestra de naranja incluyendo una tabla de resultados con confirmación de MRM positiva (izquierda) y cromatogramas (derecha)
Estos reportes fueron generados en forma automática, luego de la obtención de datos, por el propio software Cliquid , que cuenta con una gran variedad de estilos preconfigurados para reportes.
Conclusión
Se desarrollaron tres métodos LC-MS/MS para el análisis de plaguicidas presentes en las Japanese Positive List , y se aplicaron con éxito al análisis de frutas y vegetales. Para esto se utilizó el catálogo MRM del software Cliquid para testeo de rutina de alimentos y bebidas. El catálogo permite una rápida personalización del método dependiendo del objetivo analítico, sin necesidad de una lenta optimización. El método presentado está disponible como iMethod™ para ser bajado al software Cliquid para análisis rutinario de alimentos. Visite info.appliedbiosystems.com/iMethods
Estudios futuros incluirán una validación completa de diferentes métodos de preparación de muestra para minimizar los efectos de la matriz. Además, se investigará el uso de estándares internos en tales métodos de múltiple objetivo.
Autores
André Schreiber1, Yuriko Ozeki2, Dorothee Elbert3, Birgit Schlutt3, Daniel Leigh4, Nadine Harding4, Stephen Lock4, and Byron Kieser1
- Applied Biosystems (Concord, Ontario, Canadá)
- Applied Biosystems (Tokio, Japón)
- Applied Biosystems (Darmstadt, Alemania)
- Applied Biosystems (Warrington, Inglaterra)
Referencias
- Japanese Ministry of Health, Labour and Welfare—Department of Food Safety: Director Notice about Analytical Methods for Residual Compositional Substances of Agricultural Chemicals, Feed Additives, and Veterinary Drugs in Food (Syoku-An No.0124001 January 24, 2005; amendments May 26, 2006)
- L. Alder, K. Greulich, G. Kempe, B. Vieth: Mass Spectrometry Reviews 25 (2006) 838-865
- M. Anastassiades, S.J. Lehotay, D. Stajnbaher, F.J. Schenck: J. AOAC Int. 86 (2003) 412-431
- S.J. Lehotay: J. AOAC Int. 90 (2007) 485-520
- S.C. Cunha, S.J. Lehotay, K. Mastovska, J.O. Fernandes, M.B.P.P. Oliveira: J. Sep. Sci. 30 (2007) 620-632
- Cliquid® Food and Beverage Software Product Note Applied Biosystems (2007) # 114PB14-02
