El método sirve para realizar análisis de rutina de niveles bajos de testosterona en suero humano. Para la calibración se utilizan muestras de suero filtrado por carbón de una determinada concentración. Para establecer el rango de calibración se utilizan muestras de control con concentraciones clínicamente altas y bajas. Como estándar interno el método utiliza un análogo D3 deuterado de Testosterona.
La preparación de la muestra se hace por simple extracción usando una mezcla de hexano/acetato de etilo de alta pureza, seguida de una inyección en una columna HPLC (2,5 ?m C18, 100 x 2 mm) incluida en el método y conectada a la fuente Turbo V™ del espectrómetro de masas. La corrida analítica se realiza en un tiempo de 5,5 minutos por muestra, con un rango dinámico de 20-5000 pg/mL.
Figura 1: Ejemplo de cromatogramas de testosterone a 80 pg/mL con una corrida de D3-Testosterona (patrón interno) en un sistema API 5000™ LC/MS/MS
Durante la evaluación del método, los límites de cuantificación para cada analito resultaron suficientes para que el método analítico se utilice en la cuantificación de niveles de testosterona. Una precisión intra-ensayos típica (n=4) para la baja concentración es 10 %CV y una exactitude de 80% con una relación señal/ruido (S/N) de 20. S/N es la altura del pico dividida por el ruido medido a 3 desviaciones estándar del ruido.
| Analito (transición) | Nivel de estándar STD (pg/mL) | %CV promedio | S/N promedio | Límite de detección (pg/mL) con S/N = 5 |
|---|---|---|---|---|
| Testosterona 1 (289/97) | 20 | 8 | 18 | 5,6 |
| Testosterona 2 (289/109) | 20 | 10 | 15 | 6,7 |
Calibración
Las siguientes curvas de calibración representan el rango dinámico lineal de 20-5000 pg/mL, tanto para la transición cuantificadora como para la cualificadora, tal como se esperaba para este ensayo.
Figura 2. Curvas de calibración representativas para la transición MRM cuantificadora de testosterona en un sistema LC/MS/MS API 5000™ con un sistema HPLC Shimadzu Prominence durante una corrida de 5 minutos con CV (n=6) < 7% al LLOQ (20 pg/ml) y una exactitud dentro de +/- 3% para todos los STD’s y QC’s.
Figura 3. Curvas de calibración representativas para la transición cualificadora de testosterona en un sistema LC/MS/MS API 5000™ con un sistema HPLC Shimadzu Prominence durante una corrida de 5 minutos con CV (n=6) para este experimento <7 % al LLOQ (20 pg/mL).
La exactitud estuvo entre +/- 3% para todos los STD’s y QC’s.
Nótese que los resultados presentados se obtuvieron utilizando un solo instrumento y un solo juego de estándares y muestras. Antes de utilizarlo, el método debe ser completamente validado con muestras reales, y estos resultados pueden no ser idénticos en todos los instrumentos. Las variaciones en las propiedades de la columna, en los químicos, en el ambiente de trabajo y en la preparación de las muestras pueden tener un impacto en el desempeño, por lo que los presentes resultados deben tomarse como informativos.
Requisitos del sistema
Para utilizar este método como se lo describe más arriba, se necesitan los siguientes equipos y reactivos:
- Un sistema AB SCIEX API 5000™ ó AB SCIEX Triple Quad™ 5500 LC/MS/MS
- Un sistema Shimadzu Prominence 20A HPLC con botellas y bandeja reservorio, controlador del sistema CBM-20A, mezclador de 100 ?l, dos bombas isocráticas LC-20AD, degasificador de 3 canales, muestreador automático SIL-20AC y horno de columna
- Suero filtrado por carbóm
- Tubos de vidrio borosilicato para centrifuga y para manejo de muestras
- Estándar de Testerosterona y estándar interno deuterado
- Hexano y acetate de etilo grado HPLC para preparación de muestras
- Agua grado HPLC, acetonitrilo, metanol y ácido fórmico
- Tubos Eppendorf de 1,5 mL
- Guarda-columna BetaBasic Javelin 18, 5 ?m 20 x 2.1 mm
- Columna HPLC Phenomenex Luna (2,5 ?m C18, 100 x 2 mm)
- Centrífuga apta para utilizar con tubos Eppendorf y para operar a 14.000 rpm
- Pipetas y material de vidrio estándar de laboratorio
