Como mencionamos en el número anterior, hay múltiples enfoques posibles para mejorar la resolución en un menor tiempo de análisis. Pero los más prometedores parecen ser el uso de material de relleno de menor diámetro externo y la separación a temperatura elevada . En ambos casos, el objetivo es incrementar la eficiencia de la columna para lograr una buena separación en corto tiempo, sin que necesariamente implique un incremento excesivo de la presión ni modificación sustancial del hardware.

En la primera parte de esta nota, utilizamos la ecuación de Van Deemter para demostrar la incidencia del tamaño de partícula, en la resolución, al incrementar la velocidad lineal. En esta ocasión analizaremos las consecuencias de incrementar la temperatura en busca de un mejor rendimiento del sistema cromatográfico. Asimismo mostraremos dos aplicaciones interesantes de UFLC.

Estrategia II: Separación a temperatura elevada

Cada vez es mayor el interés por trabajar en LC a mayor temperatura, ya que, al incrementarla, es posible obtener simultáneamente una mejor y más rápida separación. Esta estrategia se basa en el efecto de acelerar la difusión de las especies, al tiempo que hace disminuir la resistencia al flujo en la columna.

Recordando lo visto en la sección Eficiencia cromatográfica (en la primera parte de esta nota), ambos factores A (difusión por micro corrientes localizadas y de múltiples caminos) y C (coeficiente de transferencia de masa) decrecen a medida que la temperatura aumenta. La Figura 7 muestra el efecto de la temperatura en la curva experimental de van Deemter a diferentes temperaturas. Bajo una temperatura más elevada se obtiene un HETP más bajo, especialmente a mayor caudal de fase móvil.

Figura 7: Curvas de van Deemter a diferentes temperaturas.

Condiciones cromatográficas : Shim-pack C18 (3 mm i.d. x 100 mm, 3 ?m)
Fase móvil: agua:acetonitrilo (40:60 v/v)
Detección: 245 nm
** Muestra:** mezcla Alquilfenonas.

Además, la separación a una alta temperatura tiene un efecto similar al de disminuir el diámetro de las partículas. Incrementar la temperatura mejora el efecto de la difusión del término C en la ecuación van Deemter, disminuyendo HEPT a mayores velocidades de fase móvil, aumentando a su vez la velocidad lineal óptima. La resistencia del flujo de la columna es inversamente proporcional a la temperatura; de hecho la presión a 80 ºC es aproximadamente del 40% menor que a 40 ºC.

Este hecho remarca la importancia de la temperatura como factor en la aceleración de la separación, al demostrar que el tiempo de análisis puede ser reducido eficientemente elevando el flujo de la fase móvil y la temperatura.

Siempre que, en condiciones de temperatura elevada, el material de relleno sea estable, esta estrategia es lo suficientemente potente como para conseguir mayor resolución y mayor velocidad sin hacer cambios en la configuración del sistema. La Figura 8 muestra un ejemplo del efecto del LC a temperatura elevada. Las columnas ZirChrom-PBD pueden ser utilizadas a una temperatura mayor y permiten obtener una separación adecuada en un tiempo de separación mucho menor.

Figura 8: Separación rápida usando un LC de elevada temperatura.

Condiciones cromatográficas : ZirChrom-PBD, MP; 40% acetonitrilo.
** Analitos:** valerofenona, hexafenona, heptafenona, octafenona.

En la Figura 9 se muestra otro ejemplo. Aquí, la combinación de un LC a temperatura elevada a 125 ºC con un muestreador automático hizo posible repetir la elución isocrática en un ciclo de alrededor de 30 segundos sin adoptar una técnica superpuesta de inyección, es decir, se espera que una corrida finalice para realizar la inyección de la siguiente muestra.
Figura 9: Análisis isocrático rápido a temperatura elevada.

Condiciones cromatográficas

Columna = Zir-Cromo-PBD (3mm i.d. x 50mm x 2.2 ?m)
Fase móvil = agua : acetonitrilo 70:30.
Caudal de la fase móvil = 3 mL/min.
Temperatura: 125 ºC (CRB-6A).
Analitos = uracil, tolueno, naftaleno, bifenilo.

Para que la cromatografía líquida sea exitosa a temperatura elevada, es de vital importancia la capacidad de calentamiento, ya que la existencia de gradientes térmicos causa distorsión en la forma del pico cromatográfico. El Shimadzu Prominence CTO-20A , horno de columna de convección forzada, soporta el control de la temperatura hasta 85 ºC . Los hornos son lo suficientemente potentes como para no requerir el uso de un gran precalentador (el cual es necesario para hornos por bloques calefaccionados), eliminando así el volumen muerto que éstos generan. Si se necesita una temperatura mayor a 85 ºC , se puede usar el CRB-6A , el cual puede operarse hasta 150 ºC .

El instrumento: Shimadzu Prominence, el HPLC que usted necesita para aplicaciones de Ultra Fast LC

El LC de la serie Shimadzu Prominence fue lanzado en Estados Unidos, en 2005, y en él se incorporó un gran número de mejoras mientras que se mantuvo total compatibilidad con la anterior serie LC-VP.

Entre las mejoras cruciales, cabe destacar las siguientes:

• Bomba con alta resolución (3 nL) y repetibilidad
• Velocidad de inyección ultra rápida (menos de 10 segundos)
• Operación estable y confiable aún a alta temperatura (hasta 85 ºC usando el CTO-20A y hasta 150 ºC con el CRB-6A)

Estas mejoras hacen que el Shimadzu Prominence sea el LC más adecuado para aplicaciones de Ultra Fast LC.

La Figura 10 y la Tabla 2 muestran el tiempo de retención y la reproducibilidad del área del pico (respectivamente) en una elución con gradiente extremadamente rápida, con un cambio de composición usado normalmente para obtener una buena separación en menor tiempo. Dado que el volumen de la cámara de mezcla debe reducirse fuertemente (normalmente de 2.6 mL a 100 ?L ), es muchísimo más difícil alcanzar una alta reproducibilidad en este cambio de composición (por ende en la reproducibilidad de los tiempos de retención) comparado con corridas en condiciones normales. ** Shimadzu Prominence presenta una excelente performance de bombeo con su sistema de avance micrométrico de pistón y un caudal de 3 nL de resolución, ofreciendo alta reproducibilidad en el tiempo de retención, incluso con una pequeña cámara de mezcla de 100 ?L . Además, a diferencia de otros módulos comerciales, el muestreador automático posee una aguja que está ubicada en la misma línea del flujo de la fase móvil, y puede ser usado en el análisis estándar y de alta velocidad, posibilitando una excelente precisión de inyección, con prácticamente nula contaminación cruzada entre inyecciones.

Figura 10: Corrida ultra rápida utilizando elución con gradientes.

Condiciones cromatográficas:

Columna: Shim-pack XR-ODS (3 mm x 50 mm x 2.2 ?m)
Fase móvil : A: agua. B: acetonitrilo, 0 min (50% B) ? 0.55 min (95% B) ? 0.70 min (95% B).
Caudal de la fase móvil: 1.5 mL/min.
Temperatura: 40 ºC.
Detección: UV**** 245 nm. **
Muestra:** mezcla de alquilofenona.

Tabla 2: Tiempo de retención y reproducibilidad de área del pico para corridas con gradientes muy rápidas.

La performance del sistema puede llevarse aún más lejos, como puede apreciarse en la Figura 11 , donde se alcanzó un ciclo de 23 segundos , en corridas con gradientes sin inyecciones superpuestas. En menos de un minuto se realizan tres corri das, las cuales mostraron una excelente reproducibilidad. Esto fue posible gracias al muestreador automático SIL-20A (que es ultra-rápido y no produce contaminación cruzada), en conjunto con la bomba binaria LC-20AB , de excelente performance.
Figura 11: Corridas con gradientes de ciclo ultra-rápido.

Condiciones cromatográficas:

Columna = Zir-Cromo-PBD.
Fase móvil A: Agua, B: acetonitrilo.  Gradiente (60% B) ? 0.04 min (95% B) ? 0.09 min (95% B), 3.3 mL/min
Temperatura: 80 ºC**
Detección:** absorbancia a 245 nm
Stop: 0,23 min.
Picos: acetofenona, propilfenona, butilfenona, valerofenona, hexafenona, heptafenona, octafenona.

El muestreador automático inyectaba una muestra en menos de 9 segundos y la bomba binaria cambiaba la concentración del solvente de 60% a 95% en 2.4 segundos . El horno de columna de alta performance CTO-20AC elevó la temperatura de la fase móvil a 80 ºC en un corto tiempo, para minimizar la contrapresión bajo el alto caudal de la fase móvil y para asegurar una buena forma de pico. Cabe destacar que los experimentos fueron realizados bajo 35 MPa (5000 psi).

Esto demuestra claramente que no es necesario obtener una alta presión para conseguir un alto rendimiento. La alta presión es sólo una consecuencia de usar columnas de partículas innecesariamente pequeñas.

Aplicaciones del Ultra Fast LC :
Para Shimadzu Prominence , Ultra Fast LC es simplemente una de las formas en que este versátil sistema de HPLC puede ser utilizado. A continuación se presentan un par de aplicaciones obtenidas usando columnas de 2.2 ?m. La Figura 12 muestra la separación de PTC(feniltiocarbamil)-amino ácidos. La separación completa de 17 derivados de amino ácidos se realizó en menos de 4 minutos , lo cual es seis veces más rápido que el LC con columnas de 5 ?m y dos veces más rápido que el LC de alta velocidad con columnas de 3 ?m .

Figura 12: Análisis de solución estándar de PTC - amino ácidos (400 pmol/?L cada uno).

Condiciones cromatográficas:
** **Columna: Shim Pack XR-ODS (3 mm i.d. x 75 mm x 2.2 ?m).
Fase móvil: A = 10 mM fosfato de potasio pH 7.0 ; B = acetonitrilo.
Gradiente = A:B 95:5 por 0.3 min y de 95:5 a 60:40 en 3.4 minutos.
Caudal: 1.2 mL/min.
Temperatura: 40 ºC.
** Detección:** absorbancia a 254 nm).

En la Figura 13 puede observarse otra aplicación del Ultra Fast LC utilizando el sistema Shimadzu Prominence CTO-20A , en la cual la separación exitosa de 13 derivados de la 2,4-dinitrofenilhidracina (DNP) de aldehídos y cetonas en menos de cinco minutos . Esto representa una separación 6 veces más rápida que con un LC convencional (columnas de 5 ?m ) y 3 veces más rápida que con un LC con columnas de 3 ?m .

Figura 13: Análisis de solución estándar de derivados de 2,4-DNP de aldehídocetonas (120 nmol/ 4 ?L).

Condiciones cromatográficas:
Columna = Shim Pack XR-ODS (3 mm i.d. x 75 mm x 2.2?m).
Fase móvil A = agua: THF(8/2, v/v); ** B =** acetonitrilo (A:B = 8:2).
Composición o tiempo de corrida: 5.5 min.
Caudal: 1.2 mL/min.
** Temperatura=** 50 ºC. Detección UV a 360 nm.

Conclusión

El objetivo de Ultra Fast LC no es obtener alta presión sino alta performance. Esto redunda en la mayor cantidad de muestras que se puede analizar por hora. Para alcanzar un alto rendimiento, debemos acortar tanto el tiempo de la corrida de un cromatograma como el tiempo del ciclo completo entre inyección e inyección. La solución de Shimadzu resuelve el dilema de usar columnas de partículas muy pequeñas, al proveer columnas de partículas de 2.2 ?m, lo que genera menos de la mitad de la contrapresión, comparadas con las columnas de partículas de 1.8 ?m disponibles en el mercado.

La combinación de columnas de 2.2 ?m con el sistema Shimadzu Prominence, que ya está preparado para Ultra Fast LC, da como resultado un sistema LC verdaderamente rápido. La versatilidad de Shimadzu Prominence no es sacrificada: los usuarios pueden emplear un sistema de intercambio de columnas y/o un sistema de gradiente de columna dual, junto con la configuración Ultra Fast LC.

Esta es la solución real para los usuarios que buscan mejorar las prestaciones cromatográficas en términos de performance, confiabilidad, facilidad de uso y economía.

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