La técnica LC-MS/MS se ha convertido en una importante herramienta para la medición de hormonas esteroides en estudios de investigación clínica. Históricamente estos analitos solían medirse utilizando GC-MS o inmunoensayos. Sin embargo, está generalmente aceptado que la medición de esteroides mediante inmunoensayos sufre de una falta de especificidad debida a la reactividad cruzada o interferencia, resultando en una sobreestimación de las concentraciones de suero de estos analitos. Además, las mediciones por inmunoensayos suelen mostrar una elevada variabilidad en bajas concentraciones que puede arrojar resultados engañosos o erróneos. Por otra parte, los métodos GC-MS para el análisis de esteroides normalmente implican pasos de extracción y purificación, así como una derivatización previa al análisis, lo que implica mucho tiempo y resulta poco conveniente.
Por sus múltiples ventajas (sensibilidad, selectividad, fácil preparación de muestras), hoy hay una tendencia a utilizar LC-MS/MS para el análisis de hormonas esteroides. No obstante, la medición de aldosterona en suero con esta técnica presenta dificultades analíticas debido a la baja concentración del compuesto, a las interferencias causadas por esteroides endógenos, y a la relativamente baja eficiencia de ionización intrínseca de la aldosterona.
En este trabajo se utiliza el nuevo sistema AB SCIEX Triple Quad™ 6500, capaz de mejorar el límite de cuantificación (LOQ) de aldosterona en suero humano en comparación con los métodos que actualmente se utilizan con la tecnología LC-MS/MS.
Sistema AB SCIEX Triple Quad™ 6500 con tecnología IonDrive™
** Basado en la tecnología IonDrive™, el sistema LC-MS/MS Triple Quad™ 6500 supera los estándares de performance de los equipos disponibles de espectrometría en tándem.
Ofrece una sensibilidad hasta 10 veces mayor que el modelo AB SCIEX Triple Quad™ 5500
El Detector de altas energías IonDrive™ aumenta el rango dinámico lineal hasta 6 órdenes de magnitud en modo MRM
La Fuente Turbo V IonDrive™ mejora la ionización y desolvatación de analitos y soporta un elevado caudal UHPLC (hasta 3 mL/min)
Es compatible tanto con una ionización por electospray (ESI) como con una ionización química a presión atmosférica (APCI)
El Direccionador de iones QJet IonDrive™ captura una mayor cantidad de iones a medida que ingresan en el espectrómetro de masas
El rango de masas del sistema se extiende de m/z = 5 a 2000
Es compatible con la Tecnología de movilidad de iones SelexION™, lo que aumenta sustancialmente la selectividad para ensayos difíciles
Materiales y métodos
Preparación de la muestra
La preparación de la muestra consistió de una extracción líquido-líquido utilizando metil tert-butil éter (MTBE), seguida de un secado completo y reconstitución de la muestra.
Se colocaron 500 µL de cada muestra de suero en tubos de polipropileno de 5 mL.
Se le agregaron 50 µL de una solución estándar interna de aldosterona-d7 a cada tubo, y luego se mezcló por 15 segundos.
Se le agregaron 2500 µL de MTBE a cada tubo, y luego se mezcló por 15 segundos.
Se centrifugaron las muestras a 3000 rpm durante 5 minutos.
Se transfirieron 2000 µL del sobrenadante a un tubo limpio de microcentrífuga de 2,2 mL, y se secó por completo con nitrógeno a 35 ºC.
Se reconstituyó la muestra secada utilizando 125 µL de una solución de metanol:agua (20:80 v/v), y se la colocó en un vial HPLC.
Condiciones HPLC
Se utilizó un sistema HPLC Shimadzu Prominence con una columna analítica de 150 mm de largo y 3,0 mm de diámetro interno (5 µm) mantenida a 40 ºC. Se aplicó una elución de gradiente formada por agua, 2 mM de acetato de amonio (fase móvil A) y metanol, y 2 mM de acetato de amonio (fase móvil B), en un caudal de 500 µL/min. La duración total de la aplicación del método fue de 10 minutos, asegurando la adecuada separación del analito de aldosterona de posibles interferencias endógenas. El volumen de inyección fue fijado en 50 µL.
Condiciones MS/MS
Se utilizó un sistema LC-MS/MS AB SCIEX Triple Quad™ 6500 equipado con una fuente Turbo V IonDrive™ en modo ESI negativo. Para monitorear la aldosterona se usaron dos transiciones MRM, y una para monitorear el estándar interno deuterado (aldosterona-d7). En la Tabla 1 se resumen las condiciones MRM optimizadas para el analito y el estándar interno.
Resultados
El método aquí descripto fue utilizado para analizar diferentes muestras de suero humano con distintas concentraciones de aldosterona, entre 14 pg/mL y 300 pg/mL. En la Figura 1 se ve un cromatograma representativo de una muestra con un contenido de 14 pg/mL, con un coeficiente señal/ruido de 108. Este método LC-MS/MS permitió cuantificar aldosterona en concentraciones tan bajas como de 1 pg/mL en suero humano. En la Figura 4 se presenta un blanco de solvente (izq.) y el nivel de calibración de 1 pg/mL (der.). Como se puede ver, el pico cromatográfico del nivel de calibración muestra un coeficiente señal/ruido de 18.
Por otra parte, según se ve en la Figura 5, el método presenta una excelente linealidad en todo el rango de concentraciones que va de 1 a 1000 pg/mL (r = 0,99971). Las estadísticas de la curva de calibración están resumidas en la Tabla 2. En el rango de concentraciones que va de 1 a 1000 pg/mL, la exactitud se extiende entre 89% y 118%, y el coeficiente de variación entre 0,5% y 9,1%. Para el nivel de calibración más bajo, a 1 pg/mL, la exactitud y el coeficiente de variación fueron de 100% y 8,7% respectivamente.
Para evaluar el desempeño del sistema AB SCIEX Triple Quad™ 6500 en relación con los otros instrumentos de triple cuadrupolo disponibles, se midieron tanto la intensidad de la señal como el coeficiente señal/ruido en una serie de estándares de aldosterona en solvente puro, y luego se compararon los resultados con los de un sistema Triple Quad™ 5500. En general, el Triple Quad™ 6500 ofrece una señal y un coeficiente 3 veces mejor, tal como se muestra en la Figura 6.
Para evaluar el mejorado rango dinámico lineal del sistema, se preparó una serie de estándares de aldosterona en solvente puro, cubriendo una concentración de 1 pg/mL a 1 µg/mL. Como se ve en la Figura 7, el nuevo detector de altas energías IonDrive™ permite aumentar el rango dinámico lineal hasta 6 órdenes de magnitud. La curva de calibración grafica las áreas crudas de los picos, sin necesidad de aplicar una corrección por estándar interno.
Conclusiones
El método arriba desarrollado ha demostrado ser sensible, robusto y confiable para el análisis de aldosterona en suero, con una preparación de muestra que utiliza una simple extracción líquido-líquido.
El uso del nuevo sistema AB SCIEX Triple Quad™ 6500, con tecnología IonDrive™, permite mejorar los límites de cuantificación (LOQ = 1 pg/mL), y brinda un mayor rango dinámico comparado con los modelos MS/MS anteriores de alta performance. Al graficar las áreas crudas de los picos, sin aplicar corrección por estándar interno, se observan 6 órdenes de magnitud de rango dinámico lineal, lo que permite medir los niveles de aldosterona en suero y orina utilizando el mismo método.
Referencias
- J.G. Van Der Gugten, J. Dubland, H.-F. Liu, A. Wang, C. Joseph, D.T. Holmes, J. Clin. Pathol. 2012, 10.1136/jclinpath-2011-200564
